Улучшен метод секвенирования РНК одной клетки

Подготовила Елена Клещенко

Профессор молекулярной биологии LMU Вольфганг Энард с соавторами улучшили чувствительный метод секвенирования всех РНК в единичной клетке (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) и представили свои результаты в Nature Communications .

В теле человека примерно 13 миллиардов клеток; геномы (почти) у всех одинаковые, но транскриптомы — наборы транскриптов — различаются даже в клетках одной ткани или в одной клетке в разные моменты времени. Секвенирование РНК единичной клетки позволяет определить состав популяции ее матричных РНК (мРНК) — и тем самым, в частности, белков, которые должна синтезировать клетка в данный момент времени, а также получить информацию о регуляции генов в клетке, о том, как она реагирует на инфекцию или другое воздействие. Общий принцип следующий: сначала выделяют отдельные клетки, затем лизируют их в лунках планшета; с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК на матрице РНК, то есть получают комплементарные ДНК (кДНК), амплифицируют их и секвенируют.

Ранее Энард и его коллеги испытали на эмбриональных стволовых клеток мыши шесть известных методов scRNA-seq, чтобы выявить недостатки и преимущества каждого: CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-seq, Smart-seq и Smart-seq2. Smart-seq2 обнаружил больше всего генов. CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq и SCRB-seq более точно оценивали уровни мРНК благодаря использованию уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) — коротких последовательностей, которые добавляются к каждому риду и позволяют скорректировать возможную непропорциональность в представлении различных типов кДНК после амплификации. Также выяснилось, что Drop-seq более экономически эффективен при количественном определении транскриптомов в большом числе клеток, тогда как MARS-seq, SCRB-seq и Smart-seq2 оказались более эффективными при анализе меньших количеств транскриптомов.

В новой работе авторы описали модификацию метода SCRB-seq (аббревиатура обозначает Single-Cell RNA Barcoding and Sequencing, «штрихкодирование и секвенирование РНК одной клетки»). После лизиса клеток мРНК, имеющие полиА-хвосты, взаимодействуют с праймерами, содержащими поли(Т)-участок, UMI, штрих-код, соответствующий лунке, в каждой из которых содержится одна клетка, и собственно праймер для ПЦР. После обратной транскрипции и амплификации образуются кДНК, «пронумерованные» штрихкодами, их выделяют и очищают (см. рис. 1 в статье). Штрихкод лунки и UMI дают возможность одновременно работать с множеством транскриптов из многих клеток.

Чувствительность метода увеличило добавление полиэтиленгликоля — повышение плотности среды сделало более интенсивным синтез кДНК. Кроме того, авторы использовали полимеразу Terra, что увеличило эффективность за счет более пропорциональной амплификации кДНК, без недо- или перепредставления отдельных транскриптов. Новый протокол назвали molecular crowding SCRB-seq — mcSCRB-seq (имеется в виду более плотное скопление молекул РНК в среде с полиэтиленгликолем).

Методы scRNA-seq необходимы в том числе для создания Атласа клеток человека. Вольфганг Энард участвует в этом амбициозном международном проекте, цель которого — собрать каталог всех типов клеток человека, от эмбриональных до клеток различных тканей взрослого организма.

Источники

Johannes W. Bagnoli et al. // Sensitive and powerful single-cell RNA sequencing using mcSCRB-seq // Nature Communications volume 9, Article number: 2937 (2018) DOI: 10.1038/s41467-018-05347-6

Christoph Ziegenhain et al. // Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell, 2017; 65 (4): 631 DOI: 10.1016/j.molcel.2017.01.023