address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
28 Августа, 2018

Высокоэффективный метод контроля геномного редактирования

Создана технология пространственно-временного контроля геномного редактирования; с ее помощью можно определять, где и когда активировать в клетке ферменты, редактирующие ДНК.

http://www.news.ucsb.edu

http://www.news.ucsb.edu

Подготовил Александр Колесников

Точность — одна из основных проблем геномного редактирования. Причем не только в том смысле, что изменения ДНК должны затрагивать ген-мишень, но не другие участки. Точным должен быть механизм доставки комплекса инструментов, модифицирующих ДНК, в противном случае эффективность модификации окажется очень низкой. Как правило, клетка старается избавиться от введенных извне биомолекул, бактерий, вирусов, нежизнеспособных фрагментов. На данном этапе развития флагмана технологий генной модификации — методики CRISPR/Cas9 — исследователи могут рассчитывать лишь на тот уровень эффективности, который обеспечивает используемый ими способ доставки.

Профессор кафедры химии и биохимии Калифорнийского университета в Санта-Барбаре Норберт Райх и его коллеги создали технологию, обеспечивающую пространственно-временной контроль геномного редактирования в клетке, и как следствие, эффективность в 100–1000 раз большую, чем у существующих методов. Фактически метод позволяет определить, где и когда в клетке будут активированы белки, осуществляющие геномное редактирование.

«Мы действительно можем наносить удар по отдельным клеткам, — говорит Райх. — Мы можем даже попасть в определенную часть клетки и высвобождать белок только в ней. Но самое главное, что мы контролируем место и время высвобождения ДНК-редактирующего фермента».

Использование «молекулярных ножниц», способных идентифицировать и точно модифицировать участки ДНК — CRISPR/Cas или, как в описываемой работе, Cre, фермент бактериофага P1, осуществляющий сайтспецифическую рекомбинацию, — одно из наиболее впечатляющих достижений современной биотехнологии.

Ключевой элемент технологии, разработанной группой Райха, — пустотелые наносферы из коллоидного золота, покрытые двунитевыми молекулами ДНК, к которым прикреплены химерные белки из рекомбиназы Cre и пептида, обуславливающего перенос наносфер через клеточную мембрану. Когда наносфера попадает в клетку, она оказывается в эндосоме. Компоненты рекомбиназы защищены наносферой от клеточных механизмов утилизации. Активирует их, чтобы они приступили к редактированию, сверхбыстрый лазерный импульс в ближнем инфракрасном диапазоне, безвредный для клетки и хорошо проникающий сквозь ткани. Золотые наносферы переходят в возбужденное состояние, тиоловые связи, прикрепляющие к ним молекулы ДНК, расщепляются. При этом образуются нанопузырьки, которые вскрывают мембрану эндосомы, обеспечивая выход белковых компонентов в цитоплазму. Теперь белки могут достичь клеточного ядра, где рекомбиназа будет модифицировать геном.

Авторы проверили эффективность методики на клетках HeLa, содержащих плазмиду с геном красного флуоресцентного белка DsRed, в промоторе которого была инактивирующая вставка. После обработки наночастицами, несущими рекомбиназу, и лазерным излучением клетки HeLa засветились красным — это означало, что ген DsRed в них активен. В следующем модельном эксперименте авторы обработали наночастицами клетки, растущие на размеченной подложке. Затем при помощи конфокального микроскопа выбрали микрофрагмент подложки, который облучили лазером, тогда как остальная область подложки облучена не была. В результате продукция DsRed наблюдалась только в клетках на облученной части подложки.

Новая методика позволяет получать соматические мутации — модифицировать ген в определенных клетках, не затрагивая остальные клетки организма, изучать, каким образом генная модификация меняет поведение избранной клетки или ее соседей, «Используя плазмонные наночастицы в качестве антенн-приемников [лазерного излучения], мы можем включать или выключать интересующие нас гены и наблюдать результаты изменений в реальном времени», — отметил ведущий автор работы Дин Моралес.


Принцип метода. http://www.news.ucsb.edu



Источники

Morales D. P. et al., //Light-Triggered Genome Editing: Cre Recombinase Mediated Gene Editing with Near-Infrared Light.// Small, 2018; 14 (30): 1800543 DOI: 10.1002/smll.201800543

Better Genome Editing

5521
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам