address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
27 Апреля, 2018

Вирусный РНК-геном впервые полностью отсеквенирован прямым методом

Технология секвенирования, разработанная Oxford Nanopore, позволяет напрямую определять последовательность не только ДНК, но и РНК.

MinION - Pocket sized DNA/RNA sequencing device. Credit: Oxford Nanopore Technologies

MinION - Pocket sized DNA/RNA sequencing device. Credit: Oxford Nanopore Technologies

Подготовила Елена Клещенко

Секвенирование РНК обычно начинается с обратной транскрипции — синтеза на матрице РНК комплементарной ДНК (кДНК), поскольку современные методы секвенирования, как правило, ориентированы на ДНК. Прямые методы сиквенса РНК, основанные на химической деградации радиоактивно меченной молекулы, по сути, не изменились с 70-х годов ХХ века. Однако при секвенировании кДНК теряется существенная информация — например, о модификациях РНК (их известно около ста, и роль многих остается загадкой), об особенностях сплайсинга. Кроме того, если в процессе пробоподготовки используется ПЦР, после амплификации сложно судить об изначальных соотношениях различных РНК. А все эти моменты могут быть важными при исследовании вирусов, имеющих РНК-геномы, от возбудителя простуды до вирусов полиомиелита и лихорадки Эбола.

Нанопоровое секвенирование основано на протягивании молекулы нуклеиновой кислоты сквозь белковую пору в мембране, по разные стороны которой создана разность потенциалов. Азотистые основания в составе нуклеиновой кислоты, проходя через пору, перекрывают ток ионов; регистрируя флуктуации тока, можно расшифровывать последовательность нуклеотидов. Лидер этой технологии, компания Oxford Nanopore Technologies, в январе 2018 года объявила о прямом секвенировании мРНК эукариотических клеток с помощью своего прибора MinION. А в новой работе сотрудники компании секвенировали геном вируса гриппа А, состоящий из восьми сегментов общей длиной около 13500 нуклеотидов..

Для нанопорового секвенирования РНК используют молекулы-адаптеры: двухцепочечные ДНК с одноцепочечными выступами, один из которых комплементарен консервативному участку РНК. В случае мРНК это полиА-хвост, в случае РНК гриппа — консервативная последовательность на 3’-конце. Изменяя этот адаптер, можно читать любую РНК. После этого проводилась обратная транскрипция, но не для того, чтобы секвенировать кДНК: авторы метода отмечали, что создание РНК-ДНК-дуплекса не обязательно, однако улучшает результаты, возможно, за счет разрушения вторичных структур РНК. Затем к дуплексу присоединяется еще один ДНК-адаптер, несущий моторный белок, который протягивает нить РНК с ДНК-наращением через пору.

Метод пока не идеален: потребовалось довольно большое количество вируса (его получали из инфицированных куриных яиц), и ушло много времени на исправление неизбежных ошибок секвенирования. Однако авторы работы уверены, что технологию удастся улучшить. 

Источники

Matthew W Keller et al. // Complete genome direct RNA sequencing of influenza A virus. // 2018

Flu virus finally sequenced in its native form // Nature 556, 420 (2018). DOI: 10.1038/d41586-018-04908-5

127
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам