address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
18 Сентября, 2018

Точный метод для in vivo определения сайтов нецелевой атаки нуклеаз при редактировании CRISPR

Международная группа исследователей под руководством Кейта Юнга из Гарварда и клиники Массачусетса, разработала высокочувствительную технологию детекции сайтов неспецифического расщепления нуклеазой Cas9, используемую для геномного редактирования методом CRISPR. При помощи нового метода были найдены условия, в которых побочные эффекты тканеспецифического геномного редактирования в мышиной модели сводятся к нулю.

Credit: Meletios Verras | Dreamstime.com

Credit: Meletios Verras | Dreamstime.com

Подготовил Александр Колесников

Нуклеаза Cas9, широко используемая для геномного редактирования методом CRISPR, может вносить значительное число некорректных мутаций, если сконструированная РНК-гид связывается участками генома, незначительно отличающимися от гена-мишени. И хотя этот факт понятен давно, методика, обеспечивающая количественную оценку некорректного разрезания генома, до последнего времени отсутствовала.

В работе, опубликованной в журнале Nature, исследователи описали методологию, обозначенную акронимом VIVO и способную определять с высокой степенью достоверности вероятность возникновения побочных сайтов разрезания ДНК при геномном редактировании CRISPR-Cas9. Стратегия VIVO двухступенчатая. На первом этапе сконструированную РНК-гид проверяют на селективность in vitro с использованием высочувствительной технологии, названной CIRCLE-Seq. Это изящный метод, состоящий в предварительной циркуляризации геномной ДНК in vitro, деградации остаточной линейной ДНК, обработке кольцевой ДНК нуклеазой Cas9 и последующей детекцией сформировавшихся под её действием двухцепочечных разрывов методом полногеномного секвенирования. Данный подход позволил детектировать события разрезания в изолированной ДНК как в целевых, так и в побочных сайтах с высокой эффективностью и точностью. На второй стадии VIVO, исследователи вводили нуклеазу Cas9 и РНК-гид мышам в составе аденовирусного вектора таким образом, чтобы обеспечить их тканеспецифическую экспрессию в печени. Затем выделяли ДНК из печёночных клеток и анализировали на присутствие мутаций целевым секвенированием те сайты для атаки Cas9, которые ранее определили методом CIRCLE-Seq.

Для проверки разработанного метода, исследователи первоначально использовали РНК-гид, преднамеренно сконструированную для модификации гена Psk9 таким образом, чтобы её селективность была низкой. Поскольку для низкоселективной РНК-гида CIRCLE-Seq идентифицировал очень много нецелевых сайтов разрезания Cas9 (3,107 для одной из линий мышей и 2,663 для другой), вторую стадию VIVO проводили для части сайтов, идентифицированных CIRCLE-Seq. Было показано, что значительный процент нецелевых сайтов, найденных CIRCLE-Seq, атакуются Cas9 in vivo.

При использовании высокоселективной РНК-гида, число сайтов, детектированных CIRCLE-Seq, сократилось более чем в 20 раз для обеих линий мышей. Секвенирование, проведённое после проведения CRISPR-мутагенеза in vivo, показало полное отсутствие мутаций, свидетельствующих об атаке Cas9 побочных сайтов.

«VIVO обеспечивает общую стратегию определения и подсчёта нецелевых эффектов нуклеаз, применяемых для геномного редактирования в целых организмах, создавая модель, благоприятствующую развитию терапевтических стратегий с использованием редактирования генома in vivo»,— пишут авторы.

По их данным, эта работа является первой демонстрацией того, что нуклеазы Cas, используемые для геномного редактирования, могут устойчиво вызывать нецелевые мутации in vivo. Предыдущие исследования in vivo показывали, что число таких мутаций невелико, а в некоторых случаях они и вовсе отсутствуют. Но эти работы, по мнению авторов исследования, использовали компьютерные методы, которые не были валидированы для исследований in vivo. Методология VIVO надёжно идентифицирует мутации вне целевых сайтов атаки нуклеазы даже в случае, если частота таких мутаций находится в районе 0.13%. Ключевой технологией является CIRCLE-seq, которая с запасом детектирует все возможные побочные сайты для атаки нуклеазой Cas9, включая в полном объёме те сайты, что подвергаются разрезанию in vivo.

Источник

Akcakaya P. et al. // In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations // Nature, 2018 Sep 12. DOI: 10.1038/s41586-018-0500-9

333
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам