address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
7 Февраля, 2018

Современные мультиплексные методы анализа: сотни микроорганизмов за считанные часы

В Университете Джонса Хопкинса разработали метод микрофлюидного анализа на сепсис, который позволяет определять более сотни заранее не известных видов микроорганизмов в течение трех часов.

Существующие методы прямого микробиологического анализа образцов, как правило, ориентированы на одну мишень или набор мишеней. Большое количество микроорганизмов в одной пробе позволяла обнаруживать система IRIDICA (Abbott), ранее известная под названием PLEX-ID. Эта система использовала полимеразную цепную реакцию и электроспрей-ионизационную масс-спектрометрию (PCR/ESI-MS). Тотальную ДНК экстрагировали из образца (крови, бронхо-легочной жидкости и т.п.), амплицифировали консервативные гены микроорганизмов, затем идентифицировали их по амплифицированным фрагментам с помощью ESI-MS. Подобный метод позволяет определить сотни видов бактерий и грибков, при этом анализ занимает около 6 часов.

Система разрабатывалась более десяти лет, получила маркировку CE и стала коммерчески доступной в Европе с 2014 года. Она была на рассмотрении в Управлении по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), однако в апреле 2017 года Abbott прекратил ее выпуск. Об этом с сожалением писали авторы статьи в февральском номере журнала Clinical Infectious Diseases: дело не только в том, что с рынка исчезло мощное диагностическое средство — это плохая новость для других инновационных и дорогих методов микробиологической диагностики.

Новые методы тем не менее появляются. Исследователи из Университета Джонса Хопкинса (JHU) разработали метод микрофлюидного анализа на сепсис. Исследование «пруф-оф-консепт» они опубликовали в журнале Analytical Chemistry в 2017 году, а в феврале 2018 года они получили около 4 миллионов долларов на пять лет от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США. Они предполагают создать и внедрить прибор, который будет идентифицировать патогены и выполнять фенотипическое тестирование на резистентность единичных клеток к антимикробным препаратам, — и все это в течение 3 часов после взятия образца крови.

Быстрая диагностика инфекций в кровяном русле может спасти жизнь пациента: при отсутствии эффективного лечения смертность от сепсиса увеличивается почти на 8% с каждым часом. Между тем существуют сотни бактерий, вызывающих сепсис, а панельные тесты обеспечивают идентификацию в лучшем случае десятков патогенов. Кроме того, обычно идентифицируются лишь патогены из определенного набора, то есть любой патоген, в набор не входящий, не будет «пойман». Исключение представлял IRIDICA, но и он был достаточно сложным технически.

Для идентификации неизвестных патогенов можно использовать секвенирование. В Калифорнийском университете уже начали клинические испытания теста на основе метагеномного NGS на менингит и энцефалит. FDA выпустило проект руководства по диагностическим устройствам для инфекционных заболеваний, основанным на NGS. Однако даже самые современные методы секвенирования пока еще не позволяют делать анализ достаточно быстро.

Чтобы начать лечение, недостаточно идентифицировать патоген: нужно определить его устойчивость к антибиотикам. В настоящее время для этого есть два пути: молекулярное тестирование (например, поиск гена фермента, обеспечивающего устойчивость) или фенотипическое тестирование — исследование действия противомикробного препарата на культуру патогена. Второе надежнее, так как не пропустит новую мутацию и позволит заодно определить дозу, но для выращивания культуры уйдут дни, а иногда и недели.

Существует PhenoTest BC Kit (он работает на Pheno System от Accelerate Diagnostics, недавно разрешенной FDA), который может выполнять как идентификацию, так и тестирование на чувствительность к антибиотикам. Но тест-система, предложенная в JHU, работает быстрее (3 часа вместо 8—10) и может проводить анализ прямо в образце крови.

 

Быстрая идентификация бактерий в пробе. Вверху — виды микроорганизмов определяются идентификацией кривых плавления гена 16S РНК (HRM — high-resolution melt). Внизу — определение устойчивости бактерии с помощью ПЦР в реальном времени: если бактерия чувствительна к лекарству, значение порогового цикла Cq смещается вправо. (Reprinted with permission from Anal. Chem., 2017, 89 (21), pp 11529–11536. Copyright 2017 American Chemical Society.)

Прототип устройства применяет анализ кривой плавления ДНК, чтобы исследовать вариабельные участки гена 16S; для ПЦР выбирают фиксированные фланкирующие праймеры в консервативных областях. «Используя этот подход, мы можем идентифицировать патогены, не нуждаясь в зондах», - сказал руководитель работы Джефф Ца-Хьюи Ван (Jeff Tza-Huei Wang, JHU, Institute of NanoBioTechnology )

Резистентность определяют в микрофлюидной цифровой матрице с камерами нанолитрового объема. В матрице могут протекать миллионы реакций, причем каждая камера содержит не более одной бактерии. В камеры загружают антимикробные препараты и количественно исследуют динамику роста. Оптические методы позволяют увидеть, делится ли клетка или нет, и результат можно получить быстро: время удвоения для кишечной палочки 15 мин, для золотистого стафилококка 30 мин. «Нам не нужно ждать образования колоний», — говорит Ван. Рост бактерий также можно определять с помощью ПЦР.

Устройство пройдет дальнейшую проверку в JHU, а также на факультете экстренной медицины в Стэнфордском университете.

Источники

Volkan Özenci, Robin Patel, Måns Ullberg, Kristoffer Strålin. // Demise of Polymerase Chain Reaction/Electrospray Ionization-Mass Spectrometry as an Infectious Diseases Diagnostic Tool. // Clinical Infectious Diseases, Volume 66, Issue 3, 18 January 2018, Pages 452–455, DOI: 10.1093/cid/cix743

https://www.genomeweb.com/research-funding/johns-hopkins-researchers-get-4m-develop-sepsis-id-phenotypic-antibiotic-resistance

Athamanolap P et al. // Integrated Bacterial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing Using PCR and High-Resolution Melt. // Analytical Chemistry, 2017 Nov 7; 89 (21): 11529—11536. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02809.

3090
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам