Система СRISPR/Cas9 может быть использована для исследования функции генов, участвующих в раннем эмбриональном развитии

Подготовила Марина Дмитрюкова

Ранняя дифференциация клеток в ходе эмбрионального развития имеет важное фундаментальное и клиническое значение, однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, до конца не изучены. Впервые для изучения этого механизма была применена система CRISPR/Cas9, позволяющая специфически разрезать последовательность ДНК, что ведет, в конечном итоге, к подавлению синтеза продукта гена. Наблюдая, на какой стадии происходит торможение развития, можно предположить, когда экспрессия данного гена является критичной.

Для понимания того, может ли технология CRISPR/Cas9 быть использована для исследования функции генов, команда ученых изучила, как влияет выключение гена POU5F1 на раннее развитие. Продукт гена, Oct4, начинает синтезироваться на стадии 4 – 8 клеток и регулирует дифференциацию эмбриональных клеток. Сам белок выявляется на стадии восьми клеток, и до последнего времени оставалась неясно, в какой именно момент начинается его синтез и насколько велико его участие на ранних этапах эмбриогенеза.

Исследование проводили на замороженных человеческих зиготах, полученных в программах лечения бесплодия. В исследуемую группу (37 образцов) путем микроинъекции внесли конструкцию sgRNA2b–Cas9, направленную на выключение гена POU5F1. Кроме того, 17 образцов были инъецированы только белком Cas9, для контроля техники микроинъекции.

Около 47% (8 из 17) эмбрионов, инъецированных Cas9, перешли в стадию бластоцисты — столько же, сколько и необработанных эмбрионов. Иными словами, микроинъекции не влияли на жизнеспособность эмбрионов. Однако только 19% (7 из 37) зигот, обработанных sgRNA2b–Cas9, продолжили развиваться, и структура таких бластоцист имела измененный вид. Хотя они имели заметную бластоцель, только в некоторых определялся компактный эмбриобласт, и у всех сохранялась толстая Zona pellucida. Такие эмбрионы начинали расти и формировали бластоцель, затем развитие обрывалось, и некоторые бластоцисты необратимо деградировали. Полученные результаты подтверждают, что нарушение работы Oct4 снижает жизнеспособность и качество бластоцист.

Что интересно, у эмбрионов мышей с выключенным геном POU5F1 бластоцель формировалась нормально, и развитие останавливалось на стадии зрелой бластоцисты. Это свидетельствует о том, экспрессия гена POU5F1 у человеческих эмбрионов начинается раньше и механизмы дифференциации клеток у этих двух видов различается.

Исследователи подчеркивают, что система CRISPR/Cas9 не влияет на стабильность генома, не провоцирует остановку развития на ранних этапах эмбриогенеза, и поэтому метод может быть использован для исследования функций других генов, участвующих в развитии эмбриона.

Полученные результаты помогут будущим исследованиям, которые, возможно, изменят представление о биологии человека и будут способствовать прогрессу в лечении бесплодия и терапевтическом использовании стволовых клеток.

Источник

Norah M. E. Fogarty et al. // Genome editing reveals a role for OCT4 in human embryogenesis. Nature, 2017; DOI: 10.1038/nature24033