address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
28 Сентября, 2017

Одноцепочечная эндонуклеаза повышает эффективность редактирования генома

Исследователи из Лейденского медицинского центра (Нидерланды) разработали новую методику редактирования генома. Она основана на внесении в ДНК парных одноцепочечных разрывов вместо двухцепочечных.

Фото: 123rf

Одноцепочечная эндонуклеаза повышает эффективность редактирования генома

Фото: 123rf

Подготовил Илья Скляр

Редактирование генома методом CRISPR-Cas9 состоит из двух этапов. Сначала эндонуклеаза, программируемая РНК-гидом, вносит разрывы в определенный участок хромосом. Затем клетка ликвидирует этот разрыв за счет собственных механизмов — например, путем гомологичной рекомбинации между участком хромосомы, в который внесены двуцепочечные разрывы, и донорской ДНК, добавленной экспериментаторами. Но, к сожалению, клетка часто репарирует разрывы методом негомологичного соединения концов (non-homologous end-joining, NHEJ). В результате возникают нежелательные мутации — инсерции, делеции и даже транслокации. Понятно, что это снижает потенциал метода: при таких «побочных эффектах» CRISPR-Cas9 нельзя использовать, например, в терапевтических целях.

Никазы, специфичные к определенной последовательности или к однонитевым участкам, и ранее применяли для редактирования генома, но результаты нельзя было назвать блестящими. Как утверждают авторы статьи, им удалось «улучшить все три основных параметра редактирования ДНК — эффективность, специфичность и точность».

Чтобы подтвердить эффективность новой методики, ученые провели ряд экспериментов. В первом сравнили влияние на геном однонитевых и двунитевых разрывов. Для опытах использовали мутантные формы эндонуклеазы Cas9, направляемых РНК-гидом: эти мутации изменяют каталитические центры Cas9 и превращают ее из двунитевой эндонуклеазы в никазу. Оказалось, что потенциально опасные повреждения генома чаще происходят в клетках HeLa, получивших обычную Cas9, нежели в тех, что получили никазу.

В следующей серии экспериментов было показано, что новая методология более эффективна и при модификации определенного гена. Исследователи выбрали ген DMD, мутации в котором вызывают миодистрофию Дюшенна — известное генетическое заболевание. При использовании методики одноцепочечных парных разрывов процент модифицированных по этому гену клеток был выше, чем при стандартном подходе. Метод показал свои преимущества даже в случае с плюрипотентными стволовыми клетками, редактирование генома которых сопряжено с особыми трудностями.  И, наконец, финальным штрихом стало редактирование сразу двух генов: его эффективность также возросла.

Авторы работы признают, что их метод не полностью исключает нежелательные мутации, однако надеются, что его дальнейшее развитие откроет новые перспективы генного редактирования.

Источник

Xiaoyu Chen et al.// In trans paired nicking triggers seamless genome editing without double-stranded DNA cutting // Nature Communications 8, Article number: 657 (2017). DOI: 10.1038/s41467-017-00687-1

10397
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам