Гетерорезистентность Mycobacterium tuberculosis к изониазиду можно определить с помощью анализа кривых плавления ДНК

Авторы назвали разработанный ими подход DeepMelt. Принцип метода — избирательнгое ингибирование амплификации ДНК дикого типа при полимеразной цепной реакции. В результате продукты ПЦР обогащены мутантными вариантами, и можно вычислить их исходное содержание в образце с помощью анализа кривых плавления.

Моноплексный анализ DeepMelt позволяет выявить 0,01%-ное содержание мутации katG S315T в 10⁵ геномах M. tuberculosis на микролитр. Мультиплексный DeepMelt TB/INH обнаруживает 1% мутаций в четырех локусах, связанных с резистентностью к изониазиду (INH), в 10⁴ геномов/мкл. Для сравнения, Xpert MTB/RIF детектирует резистентность, если смесь содержит не менее 65,6% мутантной ДНК. Глубокое секвенирование и некоторые другие методы выявляют 1% гетерорезистентности, но они доступны не всем медицинским учреждениям из-за высокой цены и сложности.

DeepMelt TB/INH тестировали на образцах ДНК, полученных из 602 предварительно охарактеризованных клинических изолятов. В качестве золотого стандарта использовали 1%-ный метод пропорций (метод заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде с антибиотиком, и числа колоний в контроле; штамм считается восприимчивым при падении числа колоний в присутствии лекарства до 1% от контроля и менее). 

При сравнении с золотым стандартом чувствительность теста DeepMelt TB/INH составила 95,7%, то есть увеличилась по сравнению с 93,6% у теста MeltPro TB/INH (этот тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами Китая — CFDA — авторы описали ранее). При тестировании 109 образцов мокроты с положительными мазками чувствительность теста DeepMelt TB/INH составила 91,7% (у MeltPro TB/INH 83,3%). В обоих случаях специфичность оставалась почти неизменной. Все вновь обнаруженные гетерорезистентные образцы были проверены секвенированием ДНК и цифровой ПЦР.

По мнению авторов, разработанный ими подход может занять нишу между существующими генотипическими и фенотипическими методами тестирования на лекарственную устойчивость у возбудителя туберкулеза.

Источник

Bin Liang et al. // Highly Sensitive Detection of Isoniazid Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis by DeepMelt Assay. //J. Clin. Microbiol. February 2018 56:9 e01239-17; Accepted manuscript posted online 8 November 2017, DOI: 10.1128/JCM.01239-17

Еще о микобактериях и молекулярной диагностике в Journal of Clinical Microbiology (2018, февраль)

Определение микобактерий методом полногеномного секвенирования: сравнение с традиционными методами

Идентификация различных мутаций, обеспечивающих лекарственную устойчивость у микобактерий, в одном картридже

Применение квантиферонового теста для диагностики туберкулеза у детей

Российские ученые предложили быстрый метод идентификации опасного варианта генотипа «Пекин» М. tuberculosis