CRISPR-Cas9 вызывает более обширные перестройки генома, чем считалось ранее

Подготовила Елена Клещенко

Нецелевая активность CRISPR-Cas9 — важное препятствие на пути генного редактирования в клинику. Постоянно создаются новые модификации метода, например, с использованием других ферментов вместо Cas9, улучшенные протоколы и методы детекции, чтобы минимизировать побочные эффекты. Однако считалось, что большинство нецелевых повреждений, вызванных CRISPR-Cas9, — это инделы (инсерции и делеции) в пределах 20 пар оснований, а более обширные крайне редки.

Исследование сотрудников Института Сэнгера под руководством Алана Брэдли показало, что это не так. Они предположили, что значительная часть повреждений ускользает от внимания исследователей и чтобы проверить эту гипотезу, изучили аллельное разнообразие, индуцированное Cas9, в X-хромосомном локусе PigA. Ген PigA локализован в Х-хромосоме и поэтому гемизиготен в мужских эмбриональных стволовых клетках (ЭСК). Они ввели Cas9 и гидРНК к интронам и экзонам PigA в ЭСК мыши и обнаружили, что использовании некоторых гидРНК к экзонам гена может вести к потере экспрессии PigA в 59–97% случаев. Более того, если мишени гидРНК находились в интронах, также возникали PigA-дефицитные клетки: при расстоянии между мишенью гидРНК и ближайшим экзоном 263-520 нуклеотидов — в 8–20% процентов случаев, при расстоянии 2000 нуклеотидов и более — в 5–7%.

Чтобы понять причину, исследователи амплифицировали участок размером в 5,7 т.п.н. вокруг экзона 2 и секвенировали ПЦР-продукты на платформе PacBio. Наблюдаемая картина соответствовала присутствию обширных делеций; чаще всего встречались делеции многих тысяч нуклеотидов вокруг экзона. Следовательно, потеря экспрессии PigA была вызвана потерей экзона, а не повреждением интронных регуляторных элементов.

После кластеризации ридов PacBio исследователи установили, что редактирование с использованием трех гидРНК создало 183 уникальных аллелей, от простых делеций и инсерций до комплексных перестроек. Они изолировали клоны и амплифицировали участки вокруг PigA, последовательно увеличивая расстояния между праймерами (до 16 т.п.н.). Ампликоны секвенировали методом Сэнгера.

Выяснилось, например, что почти в 75% случаев потери функции гена в результате использования одиночных гидРНК к интрону появляются делеции и в участке-мишени, и в экзонах. Самая большая достигала 9,5 тыс. пар нуклеотидов. В остальных случаях наблюдались комбинации делеций и инсерций или более сложные, множественные повреждения.

Чтобы убедиться, что подобная нецелевая активность характерно не только для стволовых клеток мыши, авторы повторили эксперимент на дифференцированных клетках человека (линии RPE1). И в них редактирование PigA привело к потере экспрессии гена и аналогичным повреждениям генома.

«Мы показали, что обширные повреждения генома — обычный результат во всех тестированных локусах и клеточных линиях. Более того, наблюдаемые генетические последствия не ограничиваются таргентым локусом, поскольку такие события, как потеря гетерозиготности, выявляют рецесссивные аллели, в то время как транслокации, инсерции и делеции могут вызвать долгосрочные последствия, связанные с транскрипцией, — заключают авторы. — Учитывая, что таргетный локус, вероятно, должен быть транскрипционно активным, мутации, которые затронут один из сотен онкогенов, могут вызвать неоплазию».

Между тем уже начаты клинические испытания терапии с использованием клеток, модифицированных CRISPR-Cas9. Результаты, полученные в Институте Сэнгера, означают, что при редактировании генома ex vivo (вне организма) нужен тщательный контроль и полный геномный анализ, прежде чем модифицированные клетки будут возвращены в организм пациента. Возможно, в свете данных результатов получат дополнительное преимущество методы CRISPR-редактирования, не предполагающие разрезания ДНК, а также ориентированные на РНК, как более безопасные (подробнее).

Источник

Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. // Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements // Nature Biotechnology, 2018. DOI: 10.1038/nbt.4192