address2arrow-email-sendarrow-rightbtn-right-arrowbubbleclosecomment-arrow-answerenvelopeeyefriendshamburgerheartHeart copy 26heart-emptyhomehumanlikelk-bubblelk-eyeHeart copy 26lk-pencilloginnav-editnav-eyenav-newsnav-starnav-userloginnext-arrow-rightpagination-lastpagination-nextShape 19 copysearchstarstar-fulluserBriefcaseCard
12 Сентября, 2018

Антибиотик из пасти медведя

Исследователи из ИБХ РАН создали технологию ультравысокопроизводительного скрининга антибактериальных веществ in vivo.

Credit: Misad | Dreamstime.com

Credit: Misad | Dreamstime.com

Александр Колесников

Российские ученые опубликовали результаты скрининга микробиома ротовой полости бурого медведя. Скрининг проводился для поиска антибактериальных веществ и продемонстрировал возможности новой технологии, использующей эмульсионную компартментализацию, микрофлюидику и многоцветную клеточную сортировку.

Исследователи обнаружили микроорганизм Bacillus pumilus, продуцирующий антибиотик амикумацин, определили механизм его биосинтеза и возникновения резистентности к антибиотику. Был также исследован спектр микроорганизмов, чувствительных и резистентных к антибиотику.

В результате можно говорить не только о разработке нового метода скрининга антибиотиков in vivo, но и о создании инструмента изучения воздействия различных природных веществ на бактериальные сообщества.

Схема эксперимента.jpg

Terekhov S. S. et al. // Ultrahigh-throughput functional profiling of microbiota communities // Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Sep 4. pii: 201811250. DOI: 10.1073/pnas.1811250115 Публикуется по Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives License 4.0 (CC BY-NC-ND).

Об истории исследования рассказывает заведующий лабораторией биокатализа ИБХ РАН, директор института, академик Александр Габибов.

Расскажите, пожалуйста, о предпосылках этой работы.

Как химика по образованию, меня уже много лет интересует проблема преодоления «одномерности» скрининга химических соединений, создания системы, способной не только анализировать множество произошедших событий одновременно, не будучи привязанной к формату пусть даже 1536-луночного планшета или микроэррея, но и проделывать это не с изолированными биомолекулярными мишенями, а в системах in vivo. Задача, конечно, непростая. И только чуть больше двух лет назад мозаика подходов стала складываться в определённую картину, и возникло понимание того, что создать такую систему возможно.

Принципиальный вклад в разработку технологических решений для новой системы внёс молодой сотрудник лаборатории Станислав Терехов. Ключевые элементы новой технологии — эмульсионные микроконтейнеры и их анализ с использованием клеточного сортера. В такой системе исследуемый микроорганизм и потенциальный продуцент антимикробных веществ разбиваются на пары не на двумерной «шахматной доске» микропланшета, а в свободном объёме, откуда могут быть быстро извлечены для последующего анализа высокопроизводительным сортировщиком клеток. Анализ отдельных микроконтейнеров может проводиться и методом масс-спектрометрии, и при помощи полногеномного секвенирования, и с использованием иных технологий.

О научном и технологическом замысле поиска новых антибиотиков рассказывает первый автор публикации кандидат биологических наук Станислав Терехов.

Почему для исследования был выбран именно медведь? Есть ли какое-то биологическое обоснование для работы именно с этим животным?

Да, обоснование есть. Выбор пал именно на медведя ввиду того, что это всеядное животное с максимально широким спектром пищевого разнообразия. Кроме того, микробиота ротовой полости медведя плохо изучена. Еще один плюс — это крупное животное, поэтому мы могли без особого труда прижизненно отобрать достаточное количество биоматериала.

Если добавить к сказанному, что, вдобавок к всеядности и в отличие от человека, медведь способен питаться падалью без вреда для пищеварения, становится понятным, что медвежий микробиом может быть поистине уникальным.

Как создаются эмульгированные капельки и как проводят их скрининг? Похожа ли эта технология на то, что используется при цифровой ПЦР?

Действительно, какие-то аналогии с ddPCR можно провести, но это, естественно, нечто совсем другое. Мы использовали биосовместимые двойные эмульсии. Это позволило использовать капли эмульсии в роли своего рода микроконтейнеров для клеток. В отличие от однократной эмульсии, эти микроконтейнеры находятся в водной фазе, что позволяет проводить с ними все манипуляции, аналогичные обычной суспензии клеток. Эмульсия обладает очень высокой стабильностью в водном растворе.

Для идентификации микроорганизмов, продуцирующих антибиотическое вещество, используется многоцветная клеточная сортировка. Клетки изучаемой микробиоты подвергаются микрофлюидной компартментализации вместе с избытком репортерных клеток Staphylococcus aureus, продуцирующих внутриклеточный GFP и прижизненно меченых красным флуорофором sCy5. Кокультивация инкапсулированных S. aureus и эффекторов микробиоты приводит к четырем различным вариантам.

I — эффектор ингибировал рост S. aureus и оставался живым в процессе кокультивации. II — эффектор и S. aureus погибали. III — эффектор и S. aureus сожительствовали в капле и не ингибировали рост друг друга. IV — S. aureus ингибировал рост эффектора. Чтобы различить эти варианты, было использовано флуорогенное гидрофобное вещество Calcein Violet AM, способный проникать через слой масла.

В случае наличия в капле живых клеток происходит гидролиз флуорогена с образованием высокогидрофильного продукта, обладающего интенсивной голубой флуоресценцией и неспособного к транспорту через гидрофобный слой масла. Таким образом, отбор популяции капель, обладающих высоким уровнем красной, низким уровнем зеленой и высоким уровнем голубой флуоресценции, приводит к отбору капель с высокой изначальной загрузкой клетками S. aureus, размножение которых в каплях было супрессировано присутствием других живых микроорганизмов.

Каковы перспективы данной технологии с точки зрения поиска новых лекарственных средств? Есть ли возможность развивать технологии высокопроизводительного скрининга с использованием описанного метода и других мишеней, например, жизнеспособных раковых клеток или одноклеточных эукариот?

Перспективы высокие. Данный метод весьма универсален и принципиально не ограничен выбором мишени. В зависимости от конкретной задачи поменяется лишь схема эксперимента и набор необходимых флуоресцентных зондов/репортерных клеточных линий.

Является ли описанная технология приоритетом авторов работы и если да, как обстоит дело с патентованием?

Да. У нас есть патент на “способ ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов и средство для ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов”. Ведется дальнейшее лицензирование.

Источник

Terekhov S. S. et al. // Ultrahigh-throughput functional profiling of microbiota communities // Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Sep 4. pii: 201811250. DOI: 10.1073/pnas.1811250115

555
0
Лидеры мнений
Лидеры отрасли
  • FUTURE
    13
САМЫЕ ОБСУЖДАЕМЫЕ ТЕМЫ ФОРУМА
Поиск материалов по тегам