О Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ Кто мы. Где находимся. Чем занимаемся. К чему стремимся. Как с нами связаться. Узнайте о нас подробнее. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ ЛАБОРАТОРИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Наша научно-исследовательская группа по изучению и внедрению молекулярно-биологических методов диагностики инфекционных заболеваний была создана в 1992 году на базе Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом при Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии МЗ РФ. ЛИЦЕНЗИЯ Центральный НИИ эпидемиолгии МЗ РФ имеет лицензию N 5623/5619 на проведение ДНК-диагностики. Наша лаборатория и специалисты имеют Государственную аккредитацию в рамках Испытательного Лабораторного Центра ЦНИИЭ МЗ РФ Все методики, использующиеся в лаборатории, прошли апробацию на клинических базах ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. ЗАДАЧИ ПЦР ЛАБОРАТОРИИ Разработка и внедрение новых молекулярно-биологических методов диагностики мониторинга инфекционных заболеваний. Проведение практической ДНК-диагностики для медицинских учереждений и частных лиц. Разработка, испытание и внедрение диагностических тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для обнаружения и мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний. ТЕХНОЛОГИЯ AmpliSens Специалисты отдела научных исследований ЦНИИЭ МЗ РФ, используя метод ПЦР, разработали и с успехом используют оригинальную технологию, названную впоследствии AmpliSens . Пять лет испытаний технологии AmpliSens на клинических базах ЦНИИЭ МЗ РФ позволили достичь максимальной чувствительности и специфичности анализа. Накопленный опыт нашего подразделения лег в основу создания тест-систем AmpliSens для диагностики и мониторинга инфекционных заболеваний, которые мы Вам предагаем (смотри раздел ТЕСТ-СИСТЕМЫ). В 1995 году нами были выпущены методические рекомендации "Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утвержденных Государственным комитетом санитарно - эпидемиологического надзора РФ. НАШ ОПЫТ март 1997 года Нашим партнером становится фирма Schering-Plough, доверившая нам мониторинг эффективности противовирусной терапии "Интроном А" при вирусных гепатитах.ноябрь 1997 года На базе нашей лаборатории начаты официальные клинические испытания основных ПЦР-тест-систем фирмы Hoffmann La Roche. декабрь 1997 года Наша лаборатория является базовой ПЦР-лабораторией фирмы Glaxo Wellcome. с 1995 года С нами сотрудничают сотни медицинских учреждений: больницы, наркологические диспансеры, лечебно-диагностические центры, женские консультации, кожно-венерологические диспансеры. ПЕРСПЕКТИВЫ Научная группа лаборатории постоянно ведет новые разработки. Скоро мы сможем предложить Вам исследования методом ПЦР на: Вирус гепатита Е, Cryptococcus neoformans, Toxoplasma gondii, Bordetella pertussis, Legionella sp. О Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ --> ПЦР, вирус, владимир пцр word test ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ Кто мы. Где находимся. Чем занимаемся. К чему стремимся. Как с нами связаться. Узнайте о нас подробнее. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ ЛАБОРАТОРИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Наша научно-исследовательская группа по изучению и внедрению молекулярно-биологических методов диагностики инфекционных заболеваний была создана в 1992 году на базе Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом при Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии МЗ РФ. ЛИЦЕНЗИЯ Центральный НИИ эпидемиолгии МЗ РФ имеет лицензию N 5623/5619 на проведение ДНК-диагностики. Наша лаборатория и специалисты имеют Государственную аккредитацию в рамках Испытательного Лабораторного Центра ЦНИИЭ МЗ РФ Все методики, использующиеся в лаборатории, прошли апробацию на клинических базах ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. ЗАДАЧИ ПЦР ЛАБОРАТОРИИ Разработка и внедрение новых молекулярно-биологических методов диагностики мониторинга инфекционных заболеваний. Проведение практической ДНК-диагностики для медицинских учереждений и частных лиц. Разработка, испытание и внедрение диагностических тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для обнаружения и мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний. ТЕХНОЛОГИЯ AmpliSens Специалисты отдела научных исследований ЦНИИЭ МЗ РФ, используя метод ПЦР, разработали и с успехом используют оригинальную технологию, названную впоследствии AmpliSens . Пять лет испытаний технологии AmpliSens на клинических базах ЦНИИЭ МЗ РФ позволили достичь максимальной чувствительности и специфичности анализа. Накопленный опыт нашего подразделения лег в основу создания тест-систем AmpliSens для диагностики и мониторинга инфекционных заболеваний, которые мы Вам предагаем (смотри раздел ТЕСТ-СИСТЕМЫ). В 1995 году нами были выпущены методические рекомендации "Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утвержденных Государственным комитетом санитарно - эпидемиологического надзора РФ. НАШ ОПЫТ март 1997 года Нашим партнером становится фирма Schering-Plough, доверившая нам мониторинг эффективности противовирусной терапии "Интроном А" при вирусных гепатитах. ноябрь 1997 года На базе нашей лаборатории начаты официальные клинические испытания основных ПЦР-тест-систем фирмы Hoffmann La Roche. декабрь 1997 года Наша лаборатория является базовой ПЦР-лабораторией фирмы Glaxo Wellcome. с 1995 года С нами сотрудничают сотни медицинских учреждений: больницы, наркологические диспансеры, лечебно-диагностические центры, женские консультации, кожно-венерологические диспансеры. ПЕРСПЕКТИВЫ Научная группа лаборатории постоянно ведет новые разработки. Скоро мы сможем предложить Вам исследования методом ПЦР на: Вирус гепатита Е, Cryptococcus neoformans, Toxoplasma gondii, Bordetella pertussis, Legionella sp. Наш адрес НАШ АДРЕС Раздел НАШ АДРЕС содержит полную почтовую информацию, телефоны и бухгалтерские реквизиты. Почтовый адрес 111123, Россия, г. Москва, Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ, ул. Новогиреевская, дом 3А, комната N11 Лаборатория ПЦР диагностики Адрес в Интернет http://www.pcr.ru Как к нам проехать станция метро "Шоссе Энтузиастов", 1 вагон из центра проезд троллейбусом N30 до остановки "Магазин СВЕТ" (12 мин) или маршрутное такси от метро "ШОССЕ ЭНТУЗИАСТОВ" 1 этаж, комната "Лаборатория ПЦР диагностики, прием анализов". Телефон +7 495 176 39 39 +7 495 304 22 01 Факс +7 495 304 22 01 . НАШИ РЕКВИЗИТЫ Название организации: Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ Идентификационный номер (ИНН): 7720024671 Код отрасли по ОКОНХ: 95120 Код организации по ОКПО: 01897593 Юридический адрес: 111123, Россия, г. Москва, ул.Новогиревская, дом 3А Наименование и адрес банка: Перовский филиал АКБ в МИБ Расчетный счет: 40503810000140002042 Корреспондетский счет: 30101810700000000417 БИК: 044583417 . Приведенные выше реквизиты являются необходимыми для оформления счетов-фактур. Хронический вирусный гепатит B и C у детей со злокачественными новообразованиями ХРОНИЧЕСКИЙ ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ В и С У ДЕТЕЙ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ: РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНТРОНОМ А О.Г. Желудкова, M.Г. Русанова, Т.А. Ишкова, И.О. Лазарева, О.Ю. Шипулина, НИИ детской гематологии МЗ и РФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ и РФ, санаторий “Русское поле” В последние годы убедительно показана возможность улучшения ближайших и отдаленных результатов лечения злокачественных новообразований за счет проведения интенсивного лечения с использованием различных программ. Однако, при применении эффективных химиопрепаратов наблюдаются побочные эффекты и осложнения — как непосредственно при проведении лечения, так и в отдаленные сроки наблюдения. Они могут препятствовать в некоторых случаях проведению химиотерапии, влияя на результагы лечения и ухудшая качество жизни больных. Полихимиотерапия у детей с онкогематологическими заболеваниями приводит к иммуносупрессии, миелодепрессии и токсическим осложнениям, что в свою очередь повышает чувствительность больных к вирусным, бактериальным и грибковым инфекциям. Цитопения, возникающая при проведении интенсивных программ полихимиотерапии, требует заместительной терапии с трансфузией препаратов крови, тем самым создавая риск контаминации вирусами гепатита В, С,D. По данным ряда авторов, около 26% детей со злокачественными новообразованиями заболевают вирусным гепатитом С на том или ином этапе лечения [1,2]. Это вынуждает делать перерывы в лечении, снижать дозы химиопрепаратов, а внекоторых случаях — даже прекращать терапию, что существенно влияет на результаты лечения злокачественных новообразований, увеличивая риск развития рецидива заболевания и экономические затраты на его лечение. ДИАГНОСТИКА И КЛИНИКА ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В и С У ДЕТЕЙ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ. Хронические вирусные гепатиты (ХВГ) у детей со злокачественными новообразованиями в большинстве случаев протекают латентно, что не позволяет своевременно диагностировать заболевание [1-5]. В связи с этим, важное значение в диагностике вирусных гепатитов приобретают лабораторные методы исследования. Разработаны критерии диагностики, которые включают биохимические, иммунологические, вирусологические и морфологические методы [б]. Ранняя диагностика, своевременно начатое и в полном объеме проведенное этиотропное лечение позволяют у значительной части больных предотвратить развитие цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Комплекс обследования при хронических гепатитах В (ХГВ) и С (ХГС) включает: 1) биохимический анализ крови (определение энзимного спектра, белково-синтетической и пигментной функции печени); 2) определение маркеров гепатитов В и С в сыворотке крови ( HBsAg, HBeAg, IgM anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe, HBV DNA; HCV RNA, Ig M anti-HCV и anti-HCV); 3) УЗИ- органов брюшной полости; 4) биопсию печени. У больных онкологическими заболеваниями, получающих полихимиотерапию, диагностика гепатитов В и С имеет некоторые особенности. У них отмечается снижение синтеза противовирусных антител вследствие иммуносупрессивного действия полихимиотерапии, в связи с этим в лабораторной диагностике основным достоверным и наиболее специфичным методом является определение HBV DNA и HCV RNA в ПЦР [3,4,7,8]. Доказано, что уровень виремии коррелирует с активностью цитолиза [7]. Некоторые авторы указывают, что даже у больных с постоянно нормальным уровнем аминотрансфераз сыворотки крови при позитивных HBV DNA и HCV RNA изменения в печени могут прогрессировать [9,10]. При этом повышение уровня АЛТ не обязательно коррелирует с активностью изменений в печени, выявляемых при гистологическом исследовании [II]. Биопсия печени проводится с целью оценки активности процесса и для определения стадии хронического гепатита, которая характеризуется степенью фиброза. По данным некоторых авторов, у детей со злокачественными новообразованиями ХГВ и ХГС не имеют специфических гистологических признаков , однако, данный вопрос требует уточнения [12,13]. Острый вирусный гепатит С у детей со злокачественными новообразованиями характеризуется высокой частотой развития хронического процесса (95%). Это подтверждается наличием в сыворотке крови этих больных HCV RNA. При этом хронизация процесса не зависит от тяжести течения острой фазы заболевания. Причина столь высокого процента хронизации вирусного гепатита С не совсем ясна. Существует предположение, что на процесс влияют несколько факторов: 1) низкий уровень репликации HCV, что ведет к недостаточной стимуляции иммунного ответа; 2) быстрое возникновение мутантных форм вируса, что позволяет HCV “избегать” иммунного надзора [14]; 3) иммуносупрессивное влияние полихимиотерапии . Прогрессирование ХГВ и ХГС в ЦП происходит в разные сроки у 30%- 40% больных [15-18] и в дальнейшем может привести к развитию ГЦК [ 19-22]. Доказано, что на Прогрессирование гистологических изменений в печени при HCV- и HBV-инфекции влияют такие факторы, как коинфекция вирусом гепатита дельта (HDV) при инфицировании HBV, одновременное инфицирование HBV, HCV, HDV, дефицит альфа-1-антитрипсина, гемохроматоз, гепатотоксичные лекарственные препараты [9]. ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКИХ ГЕПАТИТОВ В и С У ДЕТЕЙ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРА-ЗОВАНИЯМИ. Лечение хронического вирусного гепатита у детей со злокачественными новообразованиями является сложной проблемой для детских гематологов. В настоящее время используются три группы противовирусных препаратов в лечении хвг: 1) синтетические нуклеозиды (ацикловир, рибавирин, ганцикловир и др.); 2) цитокины (интерлейкин-2, фактор некроза опухоли); 3) интерфероны а. Применение препаратов первых двух групп в виде монотерапии успеха не имело. В настоящее время наибольшее применение нашли интерфероны альфа (ИФН а) — препараты, обладающие противовирусным и иммуномодулирующим действием [23]. Предпочтение отдается рекомбинантным ИФН а, среди которых наиболее широко используется — ИФН а-2b ( Интрон А, Шеринг-Плау, США ). Механизм действия интерферона включает: 1) индуцирование продукции антивирусных протеинов, ингибирующих синтез вирусных РНК и ДНК; 2) повышение экспрессии HLA-антигенов 1 типа на поверхности инфицированных клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам их распознавать и элиминировать. Интерферон обладает также иммуномодулирующим эффектом — увеличивает активность естественных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов, которые распознают инфицированные клетки и повышают высвобождение цитокинов (фактор некроза опухоли [24,25], интерлейкин -1). ИФН а, подавляя активную вирусную репликацию, уменьшает степень активности печеночного процесса и предупреждает Прогрессирование хронического гепатита в ЦП и ГЦК. Показанием к назначению противовирусной терапии является активная репликация ( выявление в сыворотке крови IgM anti-HCV, HCV RNA; HBeAg, IgM anti-HBc, HBV DNA). По данным большинства авторов, лечение хронического вирусного гепатита С у детей проводится по следующей схеме: ИФН а в дозе 3 млн. МЕ/м2 3 раза в неделю в течение 12-18 месяцев, а по данным некоторых авторов даже до 24 месяцев [8,26-27]. Препарат вводится подкожно или внутримышечно. При ХГВ ИФН а назначается в дозе 5 млн. ME/ м2 3 раза в неделю в течение 6 месяцев. Такое длительное использование препаратов обеспечивает снижение частоты рецидивов после отмены терапии, которые могут развиваться в 50% случаев [16,28]. Нами в санатории “Русское поле”, где осуществляется реабилитация детей со злокачественными новообразованиями из различных регионов России, с июня 1995 года проведено обследование 169 детей. Распределение детей по нозологиям отражено в таблице 1. Преобладание больных с острым лимфобластным лейкозом (66,9%) связано с наибольшей частотой встречаемости этого варианта лейкоза среди всех злокачественных новообразований у детей, а также с высокими показателями выживаемости, достигаемыми при применении современных программ лечения. В исследование включались больные, имевшие следующие характеристики: 1) возраст от 4 лет до 15 лет; 2) срок ремиссии от 1 года и более; 3) интенсивный курс программной химиотерапии завершен (проводится поддерживающая химиотерапия) или специальное лечение полностью закончено. Объектом обследования являлись больные, у которых в анамнезе или на момент поступления в реабилитационное отделение были повышены трансаминазы в сыворотке крови. Все больные получали многократные трансфузии препаратов крови и парентеральные манипуляции. В связи с тем, что наличие HBsAg в сыворотке крови является противопоказанием для поступления детей в санаторий, у всех больных этот маркер отсутствовал. Диагностика включала в себя определение HCV RNA и HBV DNA с помощью ПЦР до лечения ИФН >/ и в процессе терапии с использованием тест-систем, разработанных в ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Чувствительность определения вирусных РНК и ДНК составляет 1000 копий в 1 мл. Морфологическое исследование печени не выполнялось в связи с невозможностью проведения данной манипуляции в условиях реабилитационного отделения. При обследовании данной группы детей маркеры вирусного гепатита были выявлены у 89 больных (52,7%). Больные с положительными маркерами вирусного гепатита В и С распределялись следующим образом: HCV RNA выявлена у 73 больных (43,2%), HBV DNA — у 10 больных (5,8%), микст- инфекция HBV DNA + HCV RNA - у 6 (3,5%) (табл. 1). В лечении ХВГ у детей с онкогематологическими заболеваниями нами использовался рекомбинантный ИФН а-2b Интрон А, так как при его применении образование нейтрализующих антител крайне низко (не более 6%) и оно не влияет на эффективность терапии (в отличие от препаратов ИФН ^ -2а ). Интрон А был назначен 29 больным в возрасте от 4 до 14 лет ( ХГС — 23, ХГВ — 4 и микст-инфекция — 2 больных). 6 больных одновременно с Интроном А получали поддерживающую химиотерапию, у 23 — специального лечения не проводилось. Дозы и режим введения ИнтронаАбыли стандартными и зависели от этиологии вирусного гепатита (при ХГС по 3 млн ME/ м2, ХГВ — 5 млн ME/ м2, при микстинфекции доза препарата определялась видом реплицируемого вируса). Интрон А вводился 3 раза в неделю внутримышечно. В процессе лечения осуществлялся контроль за биохимическими показателями крови (определение активности АЛТ, ACT, ЩФ, ГГТП, содержание общего билирубина) ежемесячно, общего анализа крови 1 раз в 7 — 14 дней, общего анализа мочи 1 раз в месяц; проводилось ультразвуковое исследование печени и других органов брюшной полости 1 раз в 3 месяца, определение маркеров вирусного гепатита через 3, 6, 12 и 18 месяцев терапии, а также через 3 и 6 месяцев после его окончания (для выявления рецидивов) и определение антител к интерферону через 6 и 12 месяцев лечения. Таблица 1 Характеристика больных в зависимости от основного диагноза и выявленных маркеров вирусного гепатита Диагноз Количество обследованных Выявлены HCV HBV HCV + HBV Лечение (Интрон А) ОЛЛ* 113 59 52 5 2 17 ОНЛ** 11 8 7 1 - 1 НХЛ*** 11 5 3 - 2 2 ЛГМ**** 9 4 4 - - 1 Апластическая анемия 1 1 1 - - - Гистиоцитоз Х 1 - - - - - Солидные опухоли 24 12 6 4 2 8 Итого абс. 169 89 73 10 6 29 % 52,7% 43,2% 5,8% 3,5% * Острый лимфобластный лейкоз. *** Неходжкинские лимфомы. ** Острый нелимфобластный лейкоз. **** Лимфогранулематоз. Критериями эффективности лечения являлись: 1) исчезновение маркеров репликации вирусов С и В (HCV RNA, HBV DNA); 2) нормализация уровня трансаминаз в сыворотке крови. Эффективность лечения оценивали у больных, длительность терапии которых составляла 3 месяца и более (24 ребенка). Эти данные представлены в таблице 2. При обследовании через 3-6-9-12-18 месяцев отмечено отсутствие репликации вируса у 12 детей, что составило 50% (2 — ХГВ, 10 — ХГС). Этот показатель соответствует мировым стандартам терапии интерфероном. У всех больных этой труппы отмечалась нормализация трансаминаз уже через 2 месяца от начала лечения. У 12 других больных сохранялась виремия и повышение трансаминаз в сыворотке крови в 3 — 5 раз выше нормы (10 — ХГС, 1 — ХГВ, 1 — микст-инфекция). Динамика активности АЛТ у больных с различными типами ответной реакции на лечение Интроном А представлена на рисунке 1. Наши исследования показали, что эффективность проводимой терапии зависела от длительности заболевания . При раннем начале терапии в течение первых 2 лет эффект достигался у 66% больных . HCV HBV HCV+HBV Итого: До 1 месяца - - - - 2 месяца 1 - - 1 3 месяца 3 1 1 5 4 месяца 2 1 - 3 5-6 месяцев 7 - - 7 6-12 месяцев 8 2 1 11 12-18 месяцев 2 - - 2 ВСЕГО: 23 4 2 29 Побочные эффекты, характерные для терапии любыми препаратами ИФН а, наблюдались у 18 больных (75%), получающих Интрон А. При этом чаще всего отмечалось развитие гриппоподобного синдрома, который сопровождался повышением температуры до 38 градусов, ознобом, головной болью через 2—4 часа после введения препарата. Указанные симптомы сохранялись в течение 2—3 часов. Лихорадка купировалась применением парацетамола в возрастной дозировке после инъекции Интрона А. При выполнении инъекции в вечернее время и назначении парацетамола через 1 -2 часа после введения Интрона А переносимость препарата значительно улучшилась. Как правило, эти побочные явления наблюдались в течение 4—5 недель от начала терапии и затем исчезали; только у 3 больных они сохранялись в течение всего периода лечения, но не потребовали его прекращения. У 2 больных во время терапии Интроном А отмечалась лейкопения и тромбоцитопения до 1,6x106/л и 22х109/л соответственно, которые были выявлены после 3—12 недель от начала лечения и сохранялись в течение 1 — 2 месяцев. Перерыв влечении на 1 неделю способствовал повышению этих показателей, что позволило продолжать терапию в полном объеме. У 2-х больных наблюдалась кожная сыпь в месте инъекции, которая прошла самостоятельно. Образование антител к Интрону А не выявлено ни у одного из обследованных больных. Рецидивов вирусного гепатита после окончания терапии не отмечалось, однако сроки наблюдения в настоящее время еще не велики. Полученные данные свидетельствуют об эффективности Интрона А в лечении хронических гепатитов В и С у детей с онкологическими заболеваниями: репликация вируса прекратилась у 50% больных. Переносимость Интрона А больными в ходе лечения была хорошей. Побочные явления не влияли на проведение терапии в полном объеме. Наш опыт позволяет считать терапию Интроном А эффективным методом лечения ХВГ у детей со злокачественными новообразованиями, который может быть рекомендован к применению в детских онкогематологических клиниках. Рис.1. Динамика АЛТ в процессе лечения Интроном А. Литература 1. Дрондина А.К., Никитина Т.С., Ананьева Н.П., Решетняк Г.П., Рейзис А.Р. Особенности течения и терапии вирусных гепатитов В и С у детей со злокачественными новообразованиями и гемобластозами. Научно-практическая конференция: “Гепатит В, С и D — проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики”: Тезисы докладов.-М., 1995.- С.50. 2. Рейзис А.Р., Нурмухаметова Е.А. Вирусные гепатиты у детей с онкогематологическими заболеваниями. Медицина для всех.- 1996.- № 1.- С.24-27. 3. Желудкова О.Г., Бухны А.Ф., Финогенова Н.А., Ишкова Т.А., Тесленко А.П., Русанова М.Г., Попова О.В., Павлова И.П., Михайлов М.И. Диагностика и лечение хронического гепатита С у детей, больных злокачественными новообразованиями. Педиатрия. — 1996.- № 4.- С. 42-45. 4. Коломиец Н.Д., Сыцкевич О.В., Черновец-кий М.А., Алейникова О.В. и др. Диагностика и лечение вирусных гепатитов у онкогематологических больных. Научно-практическая конференция: “Гепатит В, С и D — проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики”: Тезисы докладов. — М., 1995.- С. 69. 5. Смирнов А.В. Клиника, особенности течения и исходы вирусного гепатита С у детей с соматической патологией. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н.- М., 1995. 6. Lok ASF, Ma OCK, Chan TM, et al. Overestimation of the prevalence of antibody to hepatitis С virus in retrospective studies on stored sera. Hepatology.- 1991.-Vol.l4.- P.756-762. 7. Рейзис А.Р., Дрондина А.Н., Никитина Т.С. Полимеразная цепная реакция в диагностике вирусных гепатитов В и С у детей. Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1996 .- № 2.- С. 27-30. 8. Giusti G, Pasquale G, Galante D, Russo M, Sardaro C, Gullo G, Gaeta G.B. Clinical and histological aspects of chronic HCV infection and cirrhosis. Hepato-Gastroenterol.-1993.-Vol. 40.- P 365-369. 9. Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В. и др. Клиника, течение и исходы острого вирусного гепатита С у детей. Педиатрия.- 1993.- № 3.- С. 46-49. 10. Tokushige К, Pachuk С, Wakita Т, et al. Development and immune response to HCV-core DNA vaccine constructs (Abst. 535). Hepatology.- 1994.- Vol. 20.- P.:230. 11. Горячева Л.Г., Петрова Э.М., Гусак Е.Н. Поражение печени у детей, больных острым лейкозом, и их лечение. III Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”.-1996.- С. 101-102 12. Самочатова Е.В., Михайлов М.И., Масчан А.А. и др. Этиологическая роль вирусов гепатита В и С в поражении печени у детей с онкогематологическими заболеваниями. Гематология и трансфузиология.- 1996.- № 3.- С.9-13 13. Серов В. В. Современная классификация хронических гепатитов. Русский медицинский журнал. - 1996.- № 3.- С. 179-182. 14. Jay H. Hoofnagle, Adrian M. Di Bisceglie. The treatment of chronic viral hepatitis. J. Drug Therapy.-1995.- Vol 336, N5. -P.347-356. 15. Dianzani F, Antonelli G, Capobianchi MR. The biological basis for the clinical use of interferon. J.HepatoL- 1990.- Vol. 11, Suppi 1. - P. 5-10. 16. Horf U. Lebertransplantation:heute hoho Erfolgsquoten. Symposium: cytokine bei gastroenterologischen, Erkrankun gen, Munchen.-22-23 Mai, 1992.-P.2-3. 17. Lau JYN. Hepatitis С virus: From epidemiology and molecular virology to immunobiology. Hepatology - 1994.- Vol. 20.- P. 760-762 18. Van der Poel CL, Cuypers HT, Reesink HW. Hepatitis С virus six years on. Lancet.- 1994.-Vol. 344.-P. 1475-1479 19. Chemello L.,Cavalletto L.,Bernardinello E. etal. Response to ridavirin, to interferon and to a combination of both in patients with cronic hepatits С and its relation to HCV genotypes. Hepatology.-1994, - Vol.21, Suppl.- P.12. Abstract. 20. Sherlock S. Viral hepatitis C. Curr. Opin. Gastroenterol.- 1993.- Vol. 9.- P. 341-348. 21. Tremolada F, Cassarin C, Alberti A,et al. Long-term follow-up of non-A, non-B (type C) posttransfusion hepatitis. J. Hepatol.- 1992.- Vol. 16.-P.273-281. 22. Yano M, Yatsuhashi H, Inoue 0, Koga M. Epidemiology of hepatitis C virus in Japan: role in chronic liver desease and hepaticellular carcinoma. J.Gastroenterol. Hepatol.- 1991.- Suppl 1.- P.31-35. 23. Крель П.Е., Игнатова Т.М., Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Апросина 3.Г. Противовирусная терапия хронических гепатитов В, С и D. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии”.- 1995.- № З.-С. 125-126. 24. Подымова С.Д., БуеверовА.О. Лечение хронических вирусных гепатитов. Медицина для всех. - 1996 .- № 1.- С. 20-22. 25. Zachoval R, Abb J, Zachoval V, Eisenburg J, Pape GR, Paumgartner G, Deinhardt F. Interferon alfa in hepatitis В and non-A, non-B. Defektiv production by peripheral blood mononuclear cells in chronic infection and development of serum interferon in acute disease. J.Hepatol.- 1988.- Vol. 6.- P. 364. 26. Косминкова Е.Н. Интрон А в лечении хронических вирусных заболеваний печени. Медицина для всех. — 1996 .- № 1.- С. 23. 27. Крель П.Е., Игнатова Т.М., Апросина З.Г. Опыт лечения хронического гепатита С ИНФ-аль-фа-2Ь, человеческим лейкоцитарным ИНФ-альфа и комплексом цитокинов. Клиническая фармакология и терапия. — 1996.- №1.-С. 24-27. 28. Brillianti S, Garson J, Foli M, et al. A pilot study of combination therapy with ribavirin plus interferon alfa for interferon alfa — resistant chronic hepatitis C. Gastroenterology.- 1994.- Vol. 107.-P.812-7. Article 10.htm (C) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК 616.98:578.828.6]-078.33 Г. А. Шипулин К. А. Саркисян, Е. В. Богословская, О. Ю. Шипулина, М. С. Воробьева МЕСТО ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Российский научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом, Москва В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к В И Ч с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (И Б). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и И Б [3]. Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации. Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес с момента инфицирования [31]. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ. Хотя относительное число ВИЧ-инфицированных лиц, у которых не удается обнаружить антитела, незначительно, с ростом заболеваемости частота серонегативных источников инфекции может увеличиться [З]. С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для ИФА при тестировании серонегативных образцов сывороток крови от некоторых групп населения могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в таких образцах антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом И Б. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии, не удается получить однозначные результаты И Б. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода И Б, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением [З]. Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес [Ю]. Перечисленные выше недостатки иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции уже не первый год заставляют думать о дополнении, а в ряде случаев и о замене ее методами прямой детекции вируса. Несмотря на то что до сих пор не разработана методика для прямого выявления ВИЧ, сравнимая с ИФА на антитела по эффективности, доступности и стоимости, исследования в этой области не прекращаются. Понятно, что выявление маркеров самого возбудителя ВИЧ-инфекции, являясь прямым подтверждением инфекционного процесса, могло бы помочь в решении проблем иммуноферментной диагностики. Но еще одной, не менее важной причиной возрастания интереса к этим методам, по-видимому, является то, что с их помощью можно судить об активности вируса в организме человека, а значит прогнозировать течение заболевания и проводить наблюдение за эффективностью противовирусной терапии. Тем не менее и по сей день методы выявления вируса, его антигенов или генетического материала используются на практике значительно реже, чем методы обнаружения антител к ВИЧ. Объяснение этому было найдено сравнительно недавно. В 1993 г. группе сотрудников Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США удалось показать, что во время латентной фазы инфекции основным депо активного размножения ВИЧ является лимфоидная ткань, в то время как активность репликации ВИЧ в периферической крови в это время минимальна [22]. Учитывая, что основным клиническим материалом для прямых методов диагностики ВИЧ-инфекции является кровь, становится понятно, почему эффективность выявления ВИЧ-инфицированных лиц с помощью прямых подходов, как правило, ниже таковой при использовании серологических методов - концентрация возбудителя в крови у некоторых пациентов может быть очень низкой. Недавно получены первые данные о нижних пределах содержания вируса в крови. Установлено, что до 30% пациентов с ВИЧ-инфекцией могут иметь вирус в концентрации менее 400 вирионов в 1 мл крови [11]. У части пациентов в латентном периоде концентрация вируса может снижаться до нескольких вирионов в 1 мл плазмы крови [21]. Концентрация провирусной ДНК ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови также невысока, а в отдельных случаях может быть всего лишь 10 геномов провируса на Ю^-Ю7 клеток [16, 28]. В настоящее время отсутствуют химические или физические методы, позволяющие с высокой специфичностью обнаружить вирус или его компоненты, находящиеся в такой сложной смеси как кровь и в таком разведении. Поэтому единственным методическим приемом решения этой задачи является предварительное размножение вируса или его участков до уровня чувствительности современных физико-химических методов, или использование всевозможных схем усиления сигнала. При этом самый естественный способ увеличения копийности вируса - размножение его в культуре компетентных клеток - в случае ВИЧ представляет собой крайне дорогую и трудоемкую процедуру. Хотя при наличии у исследователей соответствующих навыков, аппаратуры и упорства, вирусологический метод позволяет выделить вирус практически у 100% ВИЧ-инфицированных пациентов, в связи с техническими сложностями его применяют только в научно-исследовательских целях. Что касается методов выявления антигенов ВИЧ с помощью ИФА, необходимо отметить, что до недавнего времени они практически не использовались для диагностики ВИЧ-инфекции. Дело в том, что ИФА на антиген характеризуется низкой аналитической чувствительностью, а с другой стороны, антигены ВИЧ на протяжении латентной стадии инфекции находятся в крови в связанном с антителами состоянии. В последнее время появились сообщения об усовершенствовании методик ИФА, приведшем к существенному повышению аналитической чувствительности анализа. Например, J. Schupbach и соавт. [26] предложен вариант детекции антигена р24 методом ИФА с усилением сигнала. Чувствительность данного метода при тестировании сывороток ВИЧ-инфицированных составила 89,5%, а образцов плазмы - 97,8%, что является несомненным достижением. Однако часто по мере повышения чувствительности теста отмечается тенденция к увеличению частоты ложноположительных результатов. Поэтому для внедрения в широкую диагностическую практику иммуноферментных тест-систем для выявления антигена р24 необходимо будет продемонстрировать на большом числе серонегативных проб также и близкую к 100% специфичность анализа. В настоящее время одним из наиболее эффективных методов прямого выявления ВИЧ считают специфическую амплификацию (размножение) нуклеиновых кислот in vitro и, в частности наиболее разработанный ее вариант - полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей открыт в 1983 г. К. Mullis, в то время являвшимся сотрудником американской биотехнологической кампании "Cetus Corporation". Официальное признание важности этого открытия состоялось через 10 лет, когда К. Mullis был удостоен Нобелевской премии. Фактически уже через 2 года на основе открытого принципа благодаря усилиям сотрудников этой фирмы был разработан метод ПЦР. Сейчас практически не осталось такого направления биологии или медицины, где бы этот метод не использовался, а в ряде областей, таких, как судебная медицина, диагностика наследственных и инфекционных заболеваний, он существенно потеснил ранее используемые методические подходы. Секрет успеха здесь кроется в необыкновенной чувствительности ПЦР, позволяющей детектировать единичные искомые молекулы генетического материала в присутствии миллионов других молекул ДНК или РНК. ПЦР-анализ на клиническом материале выполняется в 3 этапа: 1) подготовка клинической пробы к проведению ПЦР, представляющей выделение суммарной ДНК и очистку ее от ингибиторов ДНК-полимеразы; 2) проведение ПЦР в автоматическом амплификаторе; 3) детектирование ампликонов методом электрофореза или ДНК-гибридизации. В том случае, если необходимо методом ПЦР размножить фрагмент ВИЧ, находящегося в биологических жидкостях в РНК-форме, ПЦР-анализ включает дополнительный этап - реакцию обратной транскрипции РНК вируса в ДНК, осуществляемую с помощью специального фермента ревертазы (обратной транскриптазы). Таким образом, обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах - ПЦР-анализ на ДНК провируса ВИЧ, интегрированного в геном мононуклеарных клеток периферической крови, и ПЦР-анализ на РНК ВИЧ, входящей в состав вирионов. Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции, а ПЦР на РНК ВИЧ - как методика для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции (в настоящем обзоре не рассматривается). Попытки применить количественный вариант ПЦР на ДНК провируса для оценки эффективности противовирусной терапии и прогноза ВИЧ-инфекции показали более низкую ценность получаемых результатов по сравнению с количественной ПЦР на РНК вируса [б]. И, наоборот, ценность ПЦР на РНК ВИЧ как метода диагностики ВИЧ-инфекции до сих пор была небольшой, так как аналитическая чувствительность (предел измерения) многих качественных методик и тест-систем на РНК ВИЧ не позволяла выявлять вирус в концентрации менее 400 молекул в 1 мл [5, 21]. Как указывалось выше, доля пациентов с вирусной нагрузкой ниже этого предела может быть значительна. В ближайшее время ситуация может измениться в связи с разработкой тест-систем, позволяющих детектировать РНК ВИЧ в нагрузке 20 молекул в 1 мл и ниже [11, 21]. Одна из первых методик ПЦР для выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 разработана в 1988 г. Праймеры, использованные для проведения реакции, разработаны исследователем американской фирмы S. Kwok на основе анализа последовательностей изолятов ВИЧ, собранных к тому времени Национальной лабораторией Los Alamos. Было предложено две пары праймеров, комплементарных консервативной области gag ВИЧ и получивших название SK38/SK39 и SK462/SK431. Первые испытания предложенной методики показали высокую степень корреляции положительных результатов ПЦР с наличием антител к ВИЧ - совпадения наблюдались в 96% случаев. При этом авторы практически не получили ложноположительных результатов на серонегативных образцах крови [17]. Данная работа стала классической, вызвав настоящий бум публикаций по данной проблеме. К сожалению, недостаточное понимание механизма ПЦР на первом этапе ее использования в клинических лабораториях привело к обескураживающим результатам. Выяснилось, что, работая по одной и той же методике, одни лаборатории не давали ложноположительных результатов реакции, в других специфичность анализа была крайне низкой. Причины этого явления оказались крайне просты. Дело в том, что в процессе ПЦР нарабатываются фрагменты ДНК (ампликоны), являющиеся в свою очередь идеальной мишенью для амплификации. При манипуляции с пробирками после проведения ПЦР, особенно если это происходит в том же помещении, где готовят и раскапывают реакционные смеси для новых ПЦР-анализов, возможной случайное попадание ампликонов в пробирки, подготовленные к анализам. В связи с высокой аналитической чувствительностью ПЦР для появления ложноположительного результата достаточно попадания 10 молекул ампликона из предыдущих реакций. В процессе ПЦР на материале, содержащем вирус, могут нарабатываться миллиарды ампликонов, которые при проведении регулярной работы накапливаются в лаборатории и контаминируют поверхности столов, растворы, пипетки и т. д., приводя к систематическим или спорадическим ложноположительным результатам [18]. Данная проблема решается путем строгого разделения ПЦР-лаборатории на три рабочие зоны, где проводится каждый из перечисленных выше этапов анализа [8]. Нами в 1995 г. разработаны подробные методические рекомендации, позволяющие полностью избежать появления ложноположительных результатов ПЦР вследствие контаминации ампликонами, бывшей одно время бичом ПЦР-лабораторий [2]. При устранении основной причины ложноположительных результатов, а также при исключении случайного переноса ДНК от пробы к пробе в процессе выделения, специфичность ПЦР-анализа определяется только специфичностью праймеров и при удачном их выборе становится близкой к 100% [8, 18]. После преодоления проблемы ложноположительных результатов ПЦР многие лаборатории предприняли попытки разработать оригинальные методики для выявления ДНК провируса ВИЧ, чувствительность которых была бы также близкой к 100%. В настоящее время накоплены данные по результатам исследований, полученных разными лабораториями с привлек чением разнообразных технологий, на более чем 2500 ВИЧ-инфицированных пациентах. На их основании можно утверждать, что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99% и практически никогда не достигает 100% [15, 29, 32]. Другими словами, в среднем 2-3% ВИЧ-инфицированных пациентов не могут быть детектированы с помощью применяемых в настоящее время вариантов ПЦР. Называются две основные причины ложноотрицательных результатов ПЦР:во-первых, очень низкое содержание провирусной ДНК ВИЧ в клетках крови, во-вторых, высокая вариабельность ВИЧ [7].Низкая концентрация провирусной ДНК в периферической крови является, согласно многим сообщениям, наиболее частой причиной ложноотрицательных результатов ПЦР. Например, J. Tosswill и соавт. [29] при анализе причин ложноотрицательных реакций ПЦР, составивших около 2%, использовали метод секвенирования изолятов ВИЧ-1, выделенных из крови ВИЧ-инфицированных. Показано, что в большинстве случаев ложноотрицательные результаты ПЦР возникают вследствие очень низкой концентрации ДНК провируса, а не из-за мутаций в местах взаимодействия праймеров и матрицы [7, 29]. В другой работе исследование причин ложноотрицательных реакций, полученных при тестировании 553 образцов мононуклеарных клеток от ВИЧ-инфицированных пациентов, показало, что в 80% случаев ложноотрицательные результаты вызваны низкой нагрузкой провирусной ДНК, а в 20% причины не установлены [32]. В нашем исследовании при тестировании 175 образцов крови от 107 пациентов с помощью разработанной ПЦР-тест-системы чувствительность составила 96%, причем в 75% случаев отрицательные результаты были, по-видимому, следствием низкой концентрации ДНК провируса [4]. Вместе с тем при анализе причин ложноотрицательных результатов ПЦР на ВИЧ нельзя не учитывать вклад необычайной вариабельности этого вируса, следствием чего является выделение двух групп (О или М) и около 10 подвидов ВИЧ-1, обозначаемых буквами английского алфавита от А до I [1]. Разница между нуклеотидными последовательностями представителей разных подвидов может достигать 30% и поэтому очень важно доказать, что праймеры, предлагаемые для диагностики ВИЧ, могут определять в ПЦР все известные подвиды. К сожалению, в 1988 г., когда была предложена система праймеров SK462/SK431, не было необходимых данных о вариабельности ВИЧ, а тем более о существовании, разнообразии и распространенности разных подвидов ВИЧ. Поэтому после появления первых обнадеживающих результатов о высокой корреляции ПЦР с помощью этих праймеров и ИФА, эта система взята за основу специалистами фирмы "Hoffman La Roche" при разработке стандартизованной ПЦР-тест-системы. Чувствительность разработанной тест-системы проверялась на американских ВИЧ-инфцированных пациентах и была определена близкой к 99%. Позднее при попытках использования данного набора в других странах обнаружилось, что его чувствительность зависит от происхождения проб крови. Например, при тестировании с помощью ПЦР-набора фирмы "Hoffman La Roche" проб крови из Уганды .чувствительность составила 70% [14], при тестировании образ-^цов из Танзании чувствительность была еще ниже - 59% [19]. Причина данного явления была вскоре установлена. Оказалось, что праймеры SK462/SK431 позволяют детектировать только 87% изолятов подвида А, 67% изолятов подвида В, 66% изоля-тов подвида Е, 88% изолятов подвида F [24]. Следовательно, чувствительность ПЦР-набора фирмы "Hoffman La Roche" может зависеть от распространенности разных подвидов ВИЧ на данной территории. Данные о чувствительности этой тест-системы на российских образцах отсутствуют, но известно, что на территории России распространено большинство из известных подвидов ВИЧ [1]. Поэтому для определения чувствительности этой тест-системы на российских образцах необходимы ее расширенные клинические испытания с привлечением проб из разных регионов России. Недавно появились сообщения о попытках специалистов компании "Hoffman La Roche" подобрать новые праймеры, выявляющие подвиды ВИЧ с более высокой эффективностью, чем предыдущий вариант. В частности, разработаны праймеры, комплементарные области ро1 ВИЧ, и экспериментально показано, что они позволяют выявлять все подвиды группы М и даже изо-ляты группы О, а также В И Ч-2 [24]. Таким образом, в ближайшее время следует ожидать коммерческой стандартизованной ПЦР-тест-системы, обладающей чувствительностью выше 98%. Возникают два вопроса: во-первых, при каких условиях возможно успешное использование ПЦР для качественного обнаружения ДНК провируса ВИЧ, во-вторых, какова должна быть стратегия рационального использования таких ПЦР-тест-систем. На первый вопрос удалось ответить еще в 1993 г., когда сотрудниками Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (Вирусологический комитет группы по клиническим испытаниям препаратов против СПИДа) была разработана и апробирована система внешнего лабораторного контроля качества работы лабораторий, использующих метод ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции. С этой целью разработана стандартная сертификационная панель, состоящая из 30 образцов осадков клеток, содержащих разное количество провирусной ДНК ВИЧ. Кроме того, в панель были включены образцы цельной крови, хорошо охарактеризованные вирусологическими, иммунологическими и серологическими методами. Зашифрованные образцы панели предоставлялись регулярно 13 лабораториям, 9 из которых использовали ПЦР-наборы фирмы "Hoffman La Roche", а остальные - наборы фирмы "Perkin Elmer". В то время как чувствительность тестирования зашифрованных образцов панели в 12 лабораториях была равна 100%, одна лаборатория, использовавшая набор фирмы "Hoffman La Roche", давала повторные ложноотрицательные результаты и поэтому была исключена из испытаний. Специфичность испытаний панели в 8 лабораториях была равна 100%, 4 лаборатории давали ложноположительные результаты, так что специфичность варьировала от 83,3 до 100%. Данная работа показала, что, даже в случае использования одних и тех же коммерческих ПЦР-наборов, необходима регулярная работа по внешнему контролю лабораторного качества, благодаря которым снижение чувствительности и специфичности может быть быстро обнаружено и устранено [13]. Что касается второго вопроса, необходимо отметить, что в первую очередь практический интерес представляет диагностика ВИЧ-инфекции методом ПЦР у новорожденных. Особенно это относится к странам с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции, например таких, как США, где ежегодно рождается до 7000 детей от ВИЧ-инфицированных женщин [10]. В 1995 г. Европейский центр по эпидемиологическому мониторингу СПИДа предложил новые критерии постановки диагноза ВИЧ-инфекции у детей в возрасте до 18 мес с использованием прямых методов диагностики, среди которых ПЦР является наиболее чувствительным, специфичным и при этом недорогим подходом по сравнению с вирусологическим методом [30]. Показано, что ПЦР на ДНК позволяет выявить до 50% истинной ВИЧ-инфекции в течение 1-го месяца жизни и 100% ВИЧ-инфицированных новорожденных к 3-б-му месяцу жизни [23]. По мнению многих авторов, вторая по важности область применения стандартизованного ПЦР-набора на провирусную ДНК ВИЧ - это верификация скрининговых результатов ИФА на антитела к ВИЧ [12¦. Изучается возможность использования ПЦР как для разрешения сомнительных результатов И Б, так и вместо И Б. Целесообразность использования ПЦР для этих целей определяется не только показателями чувствительности и специфичности самого метода, но его стоимостью, а также может зависеть от распространенности ВИЧ-инфекции в тестируемых группах. Рассмотрим преимущества и недостатки использования ПЦР для установления диагноза в тех странах, где пораженность населения составляет 10% и выше. Как известно, для населения таких стран экспертами ВОЗ рекомендуется проведение двухступенчатой диагностики методом ИФА [25]. На этапе верификации скринингового ИФА-исследования важно использовать тесты с наиболее высокой чувствительностью, поскольку таким образом, с одной стороны, могут быть выявлены пациенты в период сероконверсии, а с другой - в таких условиях высока вероятность того, что положительная или сомнительная в ИФА или в И Б сыворотка является на самом деле позитивной, а не ложноположительной [З]. Применение ПЦР-тест-системы с чувствительностью, например 98%, и специфичностью, близкой к 100%, вместо ИБ в этом случае кажется нецелесообразным, так как это привело бы в первую очередь к появлению ложноотрицательных результатов лабораторного исследования на ВИЧ. Например, при тестировании 100 000 лиц, проживающих на территории с высокой инфицированностью, при первом исследовании с помощью ИФА-тест-системы с чувствительностью 99,5% и специфичностью 99,9% будет выявлено 9950 истинно положительных сывороток и 100 ложно-положительных результатов. Предположим, что на втором этапе исследования для верификации используется ПЦР с чувствительностью 98% и специфичностью 100%. В результате будет получено 199 ложноотрицательных результатов. В то время как использование на втором этапе такой же ИФА-тест-системы привело бы к появлению только 49 ложноотрицательных результатов. С другой стороны, применение ПЦР на этапе верификации дискордантных результатов ИФА или сомнительных результатов И Б имело бы много преимуществ перед повторным применением И Б, даже при чувствительности 98%. Действительно, известно, что для сыворотки от ВИЧ-инфицированного пациента может быть получен сомнительный результат исследования на антитела в основном, когда не все маркерные антитела к белкам ВИЧ присутствуют или концентрация некоторых из них недостаточна, т. е. при сероконверсии или в терминальном периоде ВИЧ-инфекции [З]. Но именно в это время концентрация ВИЧ в крови, причем как вирусной, так и провирусной его форм, достигает максимальных величин. Учитывая, что показатели чувствительности для современных методик ПЦР установлены при тестировании случайно отобранных ВИЧ-инфицированных пациентов, среди которых подавляющее число лиц находились в стадии латентной инфекции, логично предположить, что чувствительность ПЦР в период острой инфекции должна достигать 100%. Однако ПЦР не дает сомнительных результатов. Следовательно, применение ПЦР при высокой заболеваемости ВИЧ-инфекцией на этапе верификации сомнительных результатов И Б позволит при однократном исследовании выявить все позитивные на ВИЧ образцы, но в то же время отменит длительное наблюдение за пациентами с сомнительными результатами И Б и повторное проведение анализа, необходимое для постановки лабораторного диагноза методом И Б. К тому же, стоимость ПЦР-анализа, например с помощью тест-системы фирмы "Hoffman La Roche" (40 долларов США за 1 определение), не превышает стоимости двух повторных исследований методом И Б (около 20 долларов США за 1 определение). Если заболеваемость ВИЧ-инфекцией менее 10%, для установления индивидуального диагноза специалистами ВОЗ рекомендуется применять трехступенчатую диагностику - 2 последовательных исследования методом И ФА и верификация полученных результатов методом И Б [25]. Как было показано, в популяции с низкой заболеваемостью ВИЧ-инфекцией основную проблему представляют ложноположительные результаты лабораторного исследования [З]. При использовании для верификации таких результатов тест-систем на основе И Б, обладающих близкой к 100% чувствительностью, может возникать относительно большое число сомнительных результатов тестирования. Например, М. Sherman и соавт. [27] при исследовании сывороток от 500 000 доноров крови из Нью-Йорка методом ИФА на антитела к ВИЧ выявили 1100 повторно положительных сывороток (0,22%). При тестировании этих образцов методом И Б 900 (81,8%) сывороток были отрицательными, 40 (3,6%) - положительными и для 160 (14,5%) образцов получены сомнительные результаты [27]. В таких случаях использование ПЦР вместо И Б имеет несомненное преимущество, поскольку позволяет идентифицировать все положительные пробы, но при этом практически не дает неспецифических реакций. Кроме того, необходимо учитывать, что чем ниже доля истинно позитивных проб среди всех проб с положительными результатами ИФА, тем выше (из расчета на одну пробу) затраты, необходимые для их верификации как методом ПЦР, так и методом ИБ. В то же время рост доли проб с неопределенными результатами ИБ может существенно увеличивать стоимость индивидуального лабораторного подтверждения методом И Б. Сказанное можно представить в виде математического неравенства, позволяющего определить экономическую целесообразность применения ПЦР в зависимости от стоимости ПЦР, И Б и доли неопределенных результатов И Б. Для этого введем обозначения: P(PCR) - стоимость одного исследования методом ПЦР; P(IB) - стоимость одного исследования методом И Б; N - число проб, которые предполагается верифицировать с помощью ПЦР или ИБ; п - число истинно положительных проб; nd - число проб, дающих сомнительные результаты в И Б; %nd - доля проб, дающих сомнительные результаты в И Б, в процентах. Стоимость верификации одной истинно позитивной пробы с помощью ПЦР - I(PCR) - с чувствительностью 98% и специфичностью 100% можно определить по формуле I(PCR} = P(PCR) x N/n. Стоимость верификации одной истинно позитивной пробы с помощью И Б с такой же чувствительностью можно определить по формуле I(IB) = {P(IB) x N + 2 x nd x P(IB)}/n. Определим условия, при которых I(PCR) < I(IB). Переписав приведенные выше формулы, неравенство принимает следующий вид: P(PCR) x N/n < {P{IB) x N + 2 x nd x P(IB)}/n. Умножив обе части неравенства на n и вычтя из обеих частей величину P(PCR) x N, получим P(PCR) x N - P(IB) x N< 2 x nd x P(IB). Разделим обе части неравенства на величину 2 х Р(IВ\ а затем на величину N и умножим обе части на 100. Получим %nd> {P(PCR) - P(IB)} x 100/2 x P(IB). Следовательно, стоимость верификации одной пробы будет для ПЦР ниже, чем для И Б, если будет соблюдаться это неравенство. Зная долю сомнительных результатов И Б, можно рассчитать экономическую эффективность использования ПЦР как альтернативного подхода. Например, если %nd = 50%, то при стоимости одного исследования методом И Б, равной 20 долларам США, стоимость одного ПЦР-исследования должна быть меньше 40 долларов США. В зарубежной литературе можно встретить сообщения о величинах сомнительных результатов И Б, превышающих 50%. Так, при исследовании 1066 сывороток, дважды положительных в ИФА, методом И Б J. Lee и соавт. [19] обнаружили 763 образца с сомнительными результатами ИБ, что составляет 83,7%. В таких случаях (т. е. при %nd > 50%) применение ПЦР вместо И Б может быть экономически эффективным, даже при использовании ПЦР-тест-системы фирмы "Hoffman La Roche" (40 долларов США за одно определение). По данной формуле можно также рассчитать минимальную стоимость ПЦР-тест-системы, при которой становится выгодно использовать ее, даже если специфичность И Б приближается к 100%. Так, если доля сомнительных результатов И Б равна 1%, а стоимость одного такого исследования составляет 20 долларов США, то стоимость одного исследования ПЦР не должна превышать 20,4 доллара США. Настоящая рыночная цена на ПЦР-тест-системы для обнаружения провирусной ДНК по ряду причин завышена и в ближайшие 5 лет следует ожидать ее снижения ниже уровня, равного 20 долларам США. Учитывая также, что в это же время может произойти существенное увеличение чувствительности таких тест-систем, можно прогнозировать, что в ближайшем будущем ПЦР станет серьезным конкурентом метода И Б. Нередко в литературе можно встретить утверждение, что ПЦР может также успешно заменить первый этап лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции - ИФА на антитела [9, 17]. Указывают на основное преимущество ПЦР перед ИФА, заключающееся в том, что ПЦР позволяет выявлять ВИЧ-инфицированных пациентов в период острой инфекции, когда антитела к ВИЧ не выявляются в ИФА. При обсуждении данного вопроса необходимо подчеркнуть, что достигнутые в настоящее время показатели чувствительности для ПЦР-анализа на ДНК провируса ВИЧ следует рассматривать как слишком низкие и пока они не позволяют говорить о какой-либо замене ИФА. Более того, как показали длительные испытания ПЦР-тест-системы фирмы "Hoffman La Roche", при рутинном использовании ПЦР в клинической лаборатории происходит снижение чувствительности тест-системы до 95% и ниже, что объясняют сложностью выполнения ПЦР-анализа и связанными с этим ошибками врачей-лаборантов [15]. Поэтому гораздо более эффективным кажется параллельное исследование образцов крови обоими методами. Однако необходимо учитывать, что дополнение ИФА на антитела к ВИЧ при скрининге, например донорской крови, ПЦР-анализом приведет к резкому удорожанию (в 5-10 раз без учета оборудования и трудозатрат) всей процедуры исследования. Кроме того, согласно опыту работы нашей ПЦР-лаборатории, за один рабочий день врач-лаборант может провести ПЦР-анализ не более чем 20-40 образцов крови, что не сравнимо с масштабами современной скрининговой ИФА-лаборатории. В то же время тестирование биологических материалов (крови, биоптатов и др.) от доноров органов методом ПЦР параллельно с ИФА может быть оправдано уже сегодня в связи с небольшим количеством операций по пересадке органов, выполняемых в настоящее время, и низкой стоимостью ПЦР-анализа по сравнению со стоимостью такой операции. В заключение необходимо отметить, что до сих пор идут споры о месте ПЦР в современной системе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Однако, как мы попытались показать в настоящем обзоре, уже на данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения ВИЧ, помогает разрешать сомнительные результаты И Б, а в ряде случаев может быть более дешевым и эффективным, чем И Б, инструментом верификации результатов ИФА или дополнять последний. Совершенствование и автоматизация ПЦР-анализа, а также снижение его себестоимости уже в ближайшем будущем могут существенно расширить сферу применения ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции. ЛИТЕРАТУРА 1. Бобков А. Ф., Покровский В. В., Селимова Л. М. и др. // Вопр. вирусол. - 1997. - № 6. - С. 13-16. 2. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения/ / Покровский В. В., Федоров Н. А., Шипулин Г. А. и др. - М., 1995. 3. Покровский В. В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД. - М., 1996. 4. Шипулин Г. А., Саркисян К. А., Шипулина О. Ю. //' Всесоюзное о-во эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Съезд, 7-й: Материалы. - М., 1997. - Т. 1. - С. 397-398. 5. Amplicor HIV-1 Monitor Test. Version 1.5, Instruction for Users // Roche Diagnostic Systems. - New York, 1997. 6. Bagnarelli P., Kanangat S., Rouse B. T. // J. din. Microbiol. - 1995. - Vol. 33. - P. 16-23. 7. Barlow К. L., Tosswill J. H. C., Parry J. V. et al. // Ibid. - 1997. - Vol. 35. - P. 2846-2853. 8. Bootman J. S., Kitchin P. A. // J. virol. Meth. - 1992. -Vol. 37. - P. 32-42. 9. Clark S. J., Kelen G. D.. Henrard D. R. et al. // J. infect. Dis. - 1994. - Vol. 170. - P. 194-197. 10. Domachowske J. E. // Clin. Microb. Rev. - 1996. - Vol. 9. - p. 448-468. 11. HIV-1 RNA Ultra Quant. Instruction for Users (Specialty Laboratories USA). - New York, 1997. 12. Jackson J. В., Kwock S., Sninsky S. et al. // J. din. Microbiol. - 1990. -Vol. 28. - P. 16-19. 13. Jackson J. В., Drew J.. Hsians Ju Lin et al. // Ibid. - 1993. - Vol. 31. - P. 3123-3128. 14. Jackson J. В., Piwowar E. M., Parsons J. et al. // Ibid. - 1997. - Vol. 35. - P. 873-876. 15. Jackson J. В., Parsons J. C., Nichols L. S. et al. // Ibid. - P. 1118-1121. 16. Jim-loans S., Dekker J. Т., de Ronde A. // AIDS. - 1992. - Vol. 6. - P. 337-347. 17. Kellog D. E., Kwock S. // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. - San Diego, 1980. - P. 146-152. 18. Kwock S.. ffigushi R. // Nature. - 1989. - Vol. 339. -P. 237-238. 19. Lee J. H. // J. Formos. med. Ass. - 1994. - Vol. 93, N 4. - P. 283-288. 20. Lyamiiya E., Bredberg- Raden У., Albert J. et al. // J. din. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 278-280. 21. MulderJ., Resnick R., Saget B. et al. // Ibid. - P. 1278-1280. 22. Pantaleo G., Graciou C., Demurest J. F. // Lett. to Nature. - 1993. - Vol. 362. - P. 355-358. 23. Petru A., Dunphy M. G., Aumi P. // Pediatr. infect. Dis. J. - 1992. -Vol. 11. - P. 30-33. 24. Respess R. A., Butcher A., Wang H. et al. // J. din. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 1284-1286. 25. Sato P. A., Maskwill W. J., Tomashiro H. et al. // Bull. Wid Hith Org. - 1994. - Vol. 72. - P. 129-134. 26. Schiipbach J., Flepp M., Pontelli D. et al. // AIDS. - 1996. -Vol. 10. - P. 1085-1090. 27. Sherman M. P., Dock N. L., Ehrich G. D. et al. // AIDS Res. Hum. Retrovirus. - 1995. - Vol. 11, N 3. - P. 409-414. 28. Simmonds P., Baife P., Peutherer J. F. // J. Virol. - 1990. - Vol. 64. - P. 864-872. 29. Tosswill J. //.. Barlow K. L., Parry J. V. et al. // Lancet. - 1994. _ Vol. 343. - P. 143 L 30. WHO-EC. Collaborating Centre for the epidemiological monitoring of AIDS // HIV/AIDS Surveillance in Europe. - Paris, 1995. - N 4. - P. 54. 31. Wolinsky S. M., Rinaldo С. R., Kwock S. // Ann. intern. Med. - 1989. -Vol. 111. - P. 961-972. 32. Zaw- M., Romano L., Caliicci M. et al. // J. din. Microbiol. - [993. - Vol. 31. - P. 205-208. Поступила 26.05.98 Article 11.htm Molecular Bases of Combined Subtotal Deficiencies of C6 and C7 Their Effects in Combination with Other C6 and C7 Deficiencies1 Barbara A. Fernie, Reinhard Wurzner2, Ann Orren, B. Paul Morgan3, Paul C. Potter4, Alexander E. Platonov3, Irina V. Vershinina5, German A. Shipulin5, Peter J. Lachmann, and Michael j. Hobart6 Combined subtotal deficiency of C6 and C7, in which both proteins are expressed at very low levels, has been observed in homozygous form in two families. A defect at the 5' splice donor site of intron 15 of the C6 gene explains the low molecular weight of the C6 protein and is probably responsible for its low expressed concentration. The C7 defect is more enigmatic: the protein is of normal molecular weight, low circulating concentration, and altered isoelectric point. An Arg > Ser codon substitution in exon 11 is the only molecular alteration within the mature C7 protein. These defects are associated with a characteristic set of polymorphic DNA markers in the C6/C7 region, forming a distinct haplotype. The haplotype has been found in combination with a number of other haplotypes containing defective genes that lead either to C6 or C7 deficiency, but with different consequences. Where it is combined with a Сб-deficient gene, the serum C7 levels can be surprisingly high, possibly because there is no C6 generating C56 to consume the C7. In contrast, where the C7 genes are both defective (but still partially functional), there may be a profound deficit of circulating C7 because there is ample C6 to produce C56 and consume the already small amount ofC7. Each molecular defect has also been found in isolation and has the expected effect. The journal of Immunology, 1996, 137: 3648-3657. С 6 and C7 are members of the structurally related terminal components of Complement C6 to C9. These proteins are coded by six genes: one each for C6, C7, and C9 (all linked on chromosome 5 in humans) (1-6), and one gene for each of the three polypeptide chains of C8, two of which are members of the same family and arc located close together on chromosome 1 (7-9). Following the cleavage ofC5 to C5b, the proteins function by a process of assembly, involving sequentially C6. C7, C8, and C9. to form the complex C5b-9, which is capable of forming transmembrane channels through which ions leak. leading to lysis of cells (reviewed in Ref. 10). A stable intermediate complex ofC5 and C6 can be formed in vitro by the activation of Complement in sera in which there is a molar excess of these components over C7 (11). This complex lacks the binding site for cell membranes (and other molecular complexes), which is expressed upon binding of C7. If the activation of С is due to a solid, traditionally yeast cell walls, then the trimolecular or higher complexes of C5-7 (C8 and C9) bind to the solid while the C56 accumulates in the supernatant. The imbalance of C5 and C6 over C7 is a normal phenomenon in the acute phase of inflammation and is obviously complete in genetic C7 deficiency. Whether C56 circulates in C7-deficient individuals is unproven due to the impossibility of sampling and investigating blood with guaranteed lack of complement activation. Complete deficiency of either C6 or C7 is very uncommon in most populations, but predisposes to recurrent meningococcal meningitis or to systemic gonococcal infection so that it is sometimes seen in specialist clinical practice (reviewed in Ref. 12). Subtotal deficiency of C6 and C7 (C6/C7 SD)7 was first observed in a man aged 67 yr in 1978 (13). At the same time, the linkage of the genes was established (5) and a simple hypothesis was formed that a single gene defect was influencing the expression of both genes. A second homozygous case of the condition was subsequently found in Britain (14). In addition, there are four cases of phenotypic subtotal C6 deficiency with C7 present (C6 SD) (15. 16), and an unusual case of C7 deficiency in which plasma transfusion leads to prolonged partial recovery of C7 function (17-20). FIGURE 1. a. Outline gene map ofC6 and C7 with known genetic markers. The genes are approximately 80 kbp in length each, comprise 18 exons, and are arranged 3'-to-3' about 160 kbp apart; b, protein "domain" and exon structures of C6 and C7. All these inherited conditions have relevance to the present investigation and we show that they are due to diverse combinations of gene defects. From the outset, the single defect hypothesis for the combined C6 and C7 deficiency was subject to challenge for a number of reasons. First, it had been known for some time that although C6 is an acute phase reactant whose serum concentration rises markedly following major inflammation, the concentration of C7 is not subject to this form of control (21). Second, although the isoelectric points of the traces of C6 and C7 in the combined deficient cases are not the same as those of the common alleles, only C6 shows a structural defect, being some 15% smaller than normal C6 (13). Thus, the demand for a single gene defect is that it influences the serum concentrations and the isoelectric points of two separately coded genes that are under separate regulation, and that it also causes the C6 to be small. When the structure and arrangement of the genes became clear, the single defect hypothesis became virtually untenable: the genes are fairly large (approximately 80 kbp each, 18 exons, numbered from 0 to 17 for historic reasons), and they are arranged 3'-to-3', some 160 kbp apart (22-25), which excludes the possibility of a common primary RNA transcript (Fig. 1). Genetic marker studies have been useful in the investigation of the heterogeneity of C6 and C7 deficiency (26-39). We have described various preliminary or partial investigations on the combined deficiency, which are now brought together, i.e., a point substitution in the C6 gene (40-42) and marker studies (35). We now describe the alterations in the C6 and C7 genes that are uniquely associated with subtotal deficiencies. We present further DNA marker studies and investigations of other forms of C6 and C7 deficiency, some of which have already been reported in part (19, 20, 35, 39, 40-42). With the new data, we are in a position to offer an integrated model that explains the earlier observations (13-20) and have found recombinants that strongly suggest that each of the alterations independently has the expected effect. Materials and Methods Subjects The families studied include those described (13-15, 17-20, 28. 35, 39, 42. 43). See Figure legends 2 to 7 for details. Subject 7 is a single healthy German Caucasian proband discovered to be phenotypically C6 subtotal deficient (16). Control subjects in this study were as listed below. 1) For C6 and C7 deficiency: three unrelated Сб-deficient individuals who were of different national origins, and all of whom have different haplotypes than those previously associated with deficiency or with each other. Five C7-deficient subjects were also of different origins and do not share haplotypes. 2) For the haplotype associated with C6/C7*SD: two normal individuals with the same polymorphic markers, but not the defects, one of whom is heterozygous for the C6 A/B and the C7 M/N phenotype markers. 3) For the possibility that the C7 exon 11 substitution is polymorphically distributed: 11 normal Chinese individuals. The rationale for selecting this population group is described in the results section. In addition, serum DNA (see below) from individuals phenotypically heterozygous for the C7 alleles 2, 3, and 4 were investigated and allele 10 (43) was investigated as part of the family study (family 3; see Fig. 4). 4) Other controls: six normal individuals with haplotypes other than that associated with C6/C7*SD. Table 1. Primers and products of exon PCR Exon 5' Primer Annealing Temperature Product Size 3' Primer (5' to 3') C6 Exon 15 CCTTTACCACTGCCTCTTCTCTGA 63°C 390 bp TTAAACAGGGAACTGGGCTGAGAG C7 Exon 1 TCACTTTGTACCCCATAAATT 51°C 265 bp GTTGGAGGGATACACAGATTCA Exon 2 ATTCTTTGTGTTCCCTTGCG 58°C 207 bp CCATTTTGGCCATGCCAA Exon 3 ACCAGAACAATTTTCCAGACG 59°C 310 bp (aggcctggtacctgcgtact)TGCATGCTGAGCCTATGGAA Exon 4 GGTCCTGGGTAGTGTTCTCC 57°C 242 bp GATGTACTCAGGAGGCTGCC Exon 5 GGGGAAGCTGGATAATGTATGG 57°C 447 bp AATTGACCACACATTAGGCCAT Exon 6 TGCATTTGTGCCAATGAAGAGC 58°C 502 bp TGTGCCTGGCCAGTATAAAT Exon 7 TTGGTTGATTGGAGATGAGAGC 60°C 401 bp CCCATTAAAATCCCAGAAATGCCT Exon 8 TCACTCTTGATTAGATGGCC 57°C 335 bp CCCCATGACACAAGTTTACC Exon 9 GCTCTGCCTATTCATCCCTCCC 62°C 442 bp ATTGGGATACGGAAAATGCTAATT Exon 10 TAACAAACTTACCCGTGGCT 58°C 417bp CAAGGAGCAGAGAAACAGGG Exon 11 TTGTTAGCAGGAAGCATAGC 55°C 372 bp AGTCCCTGGTAAAAATAGCC Exon 12 GATACAAAGGAGAAATCCAACG 53°C 268 bp CTTCACCATGGAGGAAGA Exon 13 GCTTGCCTGATGATTATGATTT 55°C 408 bp AGGCGGAGGGCTTATTC Exon 14 CGTCTTCCTCCTTGTCCTCT 57°C 371 bp GGACTCTCACTTGCCTGGGT Exon 15 AAGAGGCTTTTCTCCTAACG 55°C 230 bp GCTACACCTTCCATCCAACA Exon 16 AACATCTGGGGGCACTAAGC 52°C 337 bp GTACTGTGACTTTAGCATTCTTAT Exon 17 CCCAATTTCCTGGTCCTA 57°C 628 bp AAGGCCCAGAGAAGGTAA DNA preparation Genomic DNA was isolated from whole EDTA blood from control subjects (families 1, 2. and 5 and subject 7) and from frozen buffy coats from families 3 and 4 by a method modified from (44). DNA from family 6 was available in small amounts from only some members, precluding Southern blot analysis. DNA was also isolated from stored serum samples of this family using an adaptation of the published method (45). Using the QIAMP HCV kit, we were able to retrieve enough DNA from 280 ^1 serum to perform up to 10 PCR experiments. Although the kit was designed to isolate viral RNA from small amounts of body fluids, it simultaneously harvests any DNA present in the sample. The serum samples had been stored at -70°C for about 2 yr and had been thawed and refrozen several times. This method was also used for subject I.I of family 2 who is now deceased but some of whose serum was still available. Polymerase chain reaction Amplification by PCR (46) was carried out for all 17 exons of C7, and exon 15 of C6. The primers and annealing conditions used are shown in Table I. The cycle conditions were 93°C 1 min, annealing temperature 1 min, 72°C 2 min, 30 cycles in a Perkin-Elmer Cetus thermal cycler (Foster City, CA). Approximately 250 ng of template DNA was used with 50 mmol/L dNTPs, 0.5 mmol/L each oligonucleotide primer, 0.5 U Taq DNA polymerase (Promega Corp., Madison, WI) in a reaction volume of 50 ml. Southern blots Restriction digests using the enzymes BamW, EcoRl, Hindlll, and Sad (New England BIolabs, Beverly, MA) were carried out using the supplied buffers according to the manufacturer's instructions. Samples were run on 0.8% agarose gels in Tris/acetate/EDTA buffer and blotted (47) onto Hy-bond N filters (Amersham International, Amersham, U.K.) and UV cross-linked in a Stratalinker (Stratagene, Cambridge, U.K.) before hybridization to 32P-labeled (Ready To Go kit, Pharmacia, St. Albans, U.K.) C6 and C7 cDNA probes (kindly provided by Dr. Richard DiScipio, Scripps Research Foundation, La Jolla, CA). Hybridization was under standard conditions (48), washed to 0.4 X SSC and radioautographed under enhancing conditions (49). The blots were stripped of probe in boiling 0.1% SDS prior to sequential rehybridization with other C6 and C7 subclone probes. Investigation of C6 and C7 DNA marker haplotypes Full details of seven of the methods are given in Reference 32 and the eighth in Reference 33. Briefly, the markers comprise four intronic RFLPs (C6 MspI, intron 3; C6 Taqi, adjacent to exon 17; C7-233 Taqi, intron 15;C7-225 Taqi, intron 13) and three PCR-RFLPs, two of which reflect recognized phenotype markers (C6A/B, E98A, exon 3 Dde\\ C7 M/N, T565P, exon 13 Rsal and C7 S367T, exon 9 Ddel). The eighth marker is an intronic С > A point substitution in intron 12ofC7 (C7 12.-27), only 36 bp from M/N. It is detected by the amplification refractory mutation system (50) and the A form is thus far exclusively found with the C7*M type at an overall allele frequency up to 0.35, i.e., it is found in almost half of C7*M haplotypes. We have adopted a compromise nomenclature based on the recognized phenotypic names (C6 A/B; C7 M/N); heavy (H) or light (L) to describe restriction fragments (Taqi markers); + or - to designate pres ence or absence of a site (C6 MspI and C7 exon 9 Ddel) and nucleotide name (C7 A/C intron 12). The order used when describing haplotypes is that on the chromosome (23, 24): C6 А/В, C6 MspI, C6 Taqi; C7-225 Taqi, C7-233 Taqi, C7 M/N, C7 12.-27 А/С. С7 Ddel and can be abbreviated to, e.g., A-H; LHMC+. These eight bi-allelic markers define 256 possible haplotypes in the C6/C7 region (see Figure \a for the arrangement of the genes and the locations of the polymorphic sites). PAGE of DNA fragments Restriction digests of PCR products were analyzed on 10 or 12% poly-acrylamide/Tris/borate/EDTA gels, as appropriate, and stained with silver as described (32). Investigation of C6 SD: antigenic analysis of C6 protein from C6/C7 SD individuals Two mAbs (WU 6-4 and a commercial Ab from Quidel Corp., San Diego, CA) were used as coating Abs in a sandwich ELISA using a biotinylated goat polyclonal anti-C6 as detecting Ab. These experiments were carried out in parallel with those on C6 SD individuals, which have been reported in detail (42). Investigation of C6 intron 155' splice donor site defect Sequencing investigations of this defect in families 1 and 2 and two normal controls (40) and families 3 and 4 (41, 42) were carried out on PCR products of exon 15 and its flanking region (22). In initial experiments, the PCR product was cleaved at the two EcoRl sites which flank the exon, ligated into M13mp8, and a number of clones for each subject were sequenced by the dideoxy chain termination method (51). However, digestion with EcoRl proved to be unreliable for unknown reasons, and for subject 11.1 in family 5 the PCR product was end repaired, kinased, and ligated into Smal cut M13mp8 before sequencing clones as above. Initial screening of further members of families 4 and 5, of family 6, of subject 7 and three other C6QO subjects (controls) was carried out by thermal cycle sequencing of the PCR product using 32? end-labeled primers and the "Circumvent" kit (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. This provided useful information on the heterozygotes, whose PCR products were then cloned and sequenced as for family 5. Investigation of C7 SD A systematic investigation of the exons of C7 (25) was undertaken in the homozygous combined C6/C7 SD subject II. 1 from family 1. Pairs of primers flanking all 17 sequenced exons were synthesized (exon 0 codes for the 5' UT, the initiation methionine, and one other amino acid, and has not yet been cloned). The sequences of the primers and the conditions used for PCR and their products are shown in Table I. DNA from a C7-deficient patient was investigated as a control. The products were either gel purified (48) or cleaned with a Wizard PCR preps kit (Promega Corp.) and se-quenced from both ends by the Circumvent method described above. FIGURE 2. Family 1 comprises parents and four children. Subject 11.1 (the proband) is homozygous for combined C6/C7*SD (14) and further details were published as family 1 (39) and as family 2 (35). Further investigations of C7 exon 11 Following the discovery of a point substitution in exon 11 of subject 11.1 of family 1 (see Results), potentially informative individuals from families 1 to 5 and subject 7 were investigated by PCR and Circumvent sequencing. This procedure clearly identifies heterozygotes. A PCR-RFLP method was also developed for this substitution (see Results). Results Southern blot analysis Southern blots of genomic DNA from selected C6- and C7-defi-cient individuals (see family trees of C6- and C7-deficient subjects, Figures 2 to 7)8 and controls did not reveal gross gene defects or rearrangements in any subject. The molecular defect in C6 in combined deficiency The reduced size of the C6 protein found in the circulation of the subjects formed the starting point for the investigation of the molecular defect. This C6 reacts with one mAb (WU 6-4) but, by a fortunate coincidence, the only commercially available mAb to C6 (QaC6) completely failed to react with the C6 protein of either the patients with homozygous combined C6 and C7 deficiency (subject 11.1 in family 1 and subject 1.1 in family 2) or with those who 8 The data on markers and gene defects are presented as vertical haplotypes where these can be determined, or centered where this is not possible; H, heavy, L, light. have subtotal C6 deficiency but who are C7 sufticient (subject 1.2 in family 4). This lends support to the hypothesis that the molecular defect is identical in both conditions (15). Epitope mapping experiments revealed that the epitope for this Ab is at the extreme С terminus of the protein (42). Consideration of the gene structure reveals that the small exon 15 codes for a region about 15% from the С terminus. With knowledge of the flanking sequences, we were able to amplify and clone the exon. Sequencing revealed that there is a T to С transition at the second base of intron 15 (Fig. 8). This sequence is present in all the clones from the homozygous subject II. 1 in family 1. and in family 2 in approximately half the clones from the daughter and those grandchildren of the original case, subject I.1, who are hemizygous for the C6 A/B allotypes. The predicted effect of this defect is that there would be a failure of splicing at the 5' boundary of intron 15, with the intron sequence being translated until the stop codon located 18 codons downstream in intron 15 (Fig. 8). The molecular defect in C7 in combined deficiency Unlike the defective C6 gene, the C7 gene in combined C6 and C7 deficiency directs the synthesis of a protein of normal size, but a different isoelectric focusing pattern from the common C7*1 al-lele. We therefore had no indication of the likely nature or location of the defect other than that it was probably associated with an amino acid change and was therefore to be found in an exon. We sequenced the exons amplified from the homozygous case (subject 11.1 in family 1) using primers located in the introns to prepare single-exon PCR products. Successful PCR amplification and sequencing was achieved for all exons other than exon 0, which contains only two codons that are not present in the mature protein and which has not yet been cloned. А С to A transversion at position 72 of exon 11 was found in this subject and causes the substitution of an Arg by a Ser at position 499 (cDNA 1561) (52). Further investigations of the substitution were carried out by PCR followed by either thermal cycle sequencing or restriction digest. The point substitution creates a TspRI site (recognition sequence NNCAGTGNN') which is absent from the normal sequence (CCGTG). The full exon 11 PCR product of 372 bp contains one invariant TspRI site, generating fragments of 193 and 179 bp when the substitution is absent and 193, 155, and 24 bp when it is present. Ten microliters of PCR product was digested with 5 U TspRI (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions and the products were analyzed on 10% polyacrylamide gels and silver stained. This method was applied to all family 6, some other family members not sequenced as above and controls. Results are shown in the family trees (Figures 2 to 7). Since isoelectric focusing variants of C7 are uncommon in Cau-casoids, and since the amino acid substitution involves a positive to neutral alteration, we can immediately be sure that this substitution is not polymorphically distributed in that population group. C7 charge variants are much more common in Oriental populations (53-55), but we did not find it in 11 normal Chinese controls, two normal British controls who share the marker haplotype associated with combined C6/C7*SD (see below), six other normal Britons, subjects with the isoelectric focusing alleles 2, 3, 4, and 10, or any of the C6- or C7-deficient control subjects. One control individual, who has the same marker haplotype as the combined deficient and who is phenotypically C6 AB, C7 MN and quantitatively normal for both, has neither the C6 nor the C7 molecular defects. FIGURE 3. Family 2 comprises some surviving members of the family of the first case of C6/C7 SD (13). Further details of this family were published as family 2 (39) and as family 3 (35). The proband, subject 1.1, is now deceased. Application of molecular markers in the C6/C7 region and defect detection to deficiency states Investigation of the eight markers permits the following observations with regard to subtotal C6 deficiency: 1) The A + H; HHMA- haplotype is associated with both defects found in combined deficiency in families 1 and 2 (Figs. 2, 3, and 9a). It segregates in family 3 (Figs. 4 and 9b) and in subjects 11.1,11.3, and 11.5 is combined with the haplotype B-L; LLMA+, characteristic of C6*QO in South Africa (35) and Table II. Subject 11.5 from family 3 (F3.II.5) has been shown to be heterozygous for the C6 intron 15 boundary defect (41, 42) and subjects 1.2, 11.2, and 11.5 are also heterozygous for the C7 exon 11 defect. A German subject (individual 7) with subtotal C6 deficiency has all the alleles to make up the combined deficient haplotype, is heterozygous for both the C6 and C7 defects, and is probably heterozygous for C6*QO, the latter on a haplotype different from that of the common South African C6*QO. His haplotypes cannot be deduced as he is heterozygous at three different C7 loci, i.e., A + H; H/L H M A/C+/-. 2) A South African subject, family 4 11.2 (Fig. 5), carries only the C6 segment of the combined deficiency haplotype as his C7 haplotype segment differs at one locus. He has the C6 intron boundary defect (41, 42) but he demonstrably expresses the C7 allotype from both chromosomes since he is phenotypically heterozygous for the C7 M/N antigenic marker. The C7*M allele is carried on the chromosome bearing the C6 intron 15 boundary defect. Neither he nor his mother, subject 1.2, from whom he inherited the C6*SD gene and who is also heterozygous for C6*QO (35), has the C7 exon 11 defect and neither does his father (see family tree. Figs. 5 and 9d). Marker investigations on selected C7-deficient subjects show the following: 3) Subject 11.1 of family 5, who has a complex phenotypic deficiency ofC7 (19-20), carries one copy of the A + H; HHMA- haplotype characteristic of combined C6/C7 SD inherited from his father. He expresses C7 under favorable circumstances, so that his serum C7 concentration rises to 10 to 15% of the normal value a few days after transfusion with C7 N plasma. The C7 found is endogenous, as demonstrated by its M allotype. He is heterozygous for both the C6 intron 15 boundary and C7 exon 11 defects. Both his mother and half-brother are normal at the C6 intron 15 boundary and neither have the C7 exon 11 defect (Figs. 6 and 9c). On isoelectric focusing, his C7 appears to be a mixture of common Caucasian allele C7-1 and the unusual C7 seen in combined deficiency (13, 15). This suggests that he is heterozygous for combined deficiency and another partial C7 defect inherited from his mother, which we term C7*VL (very low). Were the C7-1 allele normally expressed, it would be expected to mask the very small traces of the C7 SD protein on the focusing gel. FIGURE 4. Family 3 is a South African family comprising parents and five children, and has been extensively investigated as family A (15, 42, 43) and as family 4 (35, 39). This family is known to carry the C6*SD gene (42) and the full haplotype for the combined C6/C7*SD is present (35). Rare isoelectric focusing variants of both C6 and C7 segregate on another haplotype in combinations that demonstrate the presence of a C6*QO gene on a third chromosome (43). Daughter 11.2 is phenotypically C6 Rare/C7 10, which shows that her deficient chromosome carries both the C6*SD gene and a C7-deficient gene. The fourth chromosome has no special features. FIGURE 5. Family 4 is a South African family comprising parents and three children and has previously been published as part of family В (15, 42), family 3 (39), and family 5 (35). This family is known to carry both the C6*SD and C6*QO genes but the full haplotype for the combined C6/C7*SD is not present and it can be demonstrated that C7 is normally expressed. 4) Subjects 11.1 and 11.2 of family 6 with phenotypic C7 deficiency carry the MA- part of the C7 haplotype characteristic of combined deficiency (see family tree. Figs. 7 and 9e), and have the C7 exon 11 substitution, which they have inherited from their mother, subject 1.2. Their paternal haplotype is probably associated with C7*QO as the father has low C7 levels (subject I.I). Their sister, subject 11.3, is entirely normal having inherited the two normal chromosomes of her parents. All members of the family produce C6 directed by both chromosomes as they are all phenotypically C6 AB and none has the C6 intron 15 boundary defect. Members of this family are the only persons who have been detected with the C7 exon 11 defect in isolation from the C6 intron 15 boundary defect. Discussion The view we have formed of these data can be modeled as follows (see also Fig. 9). Combined C6/C7*SD subtotal deficiency is found in homozygotes where the haplotype A+H ; HHMA- is associated with a defect at the boundary of intron 15 of the C6 gene and а С > А substitution in exon 11 of the C7 gene (i.e., Fl.II.l) (Fig. 9e). Individuals heterozygous for the A + H ; HHMA- haplotype with the C6*SD and C7*SD defects and for a C6*QO gene are phenotypically C6 subtotal deficient (Fig. 9b), as a result of some production from the C6/C7*SD chromosome (15, 42), but may have near normal C7 levels as they have reduced capacity for C7 consumption, being largely without C6. Furthermore, the normal C7 encoded by the chromosome carrying C6*QO prevents ready phenotypic detection of the abnormal C7 encoded by the combined subtotal deficient chromosome (i.e., F3.II.1, F3.II.3, and F3.II.5). However, with hindsight, heterozygotes for combined C6/C7*SD with a normal C7*N allele can be seen to have detectable traces of C7 M Ag, but at values too low to be claimed in the absence of supponing DNA data (i.e.. F2.III.4) (38), FIGURE 6. Family 5 is a Russian family comprising mother and two sons who are half-brothers. One son, subject 11.1, is phenotypically C7-deficient (17) and has subsequently been found to be heterozygous for combined C6/C7*SD and another, as yet uncharacterized, C/^SD gene (20). He has previously been reported as patient 21, kindred 17 (Table I) (17, 19). An individual (F5.II.1) heterozygous for the same C6/C7*SD haplotype and for another defective C7 gene (C7*VL) is phenotypically C7 deficient due to consumption of his C7 by the C56 complex generated from the normal C6 encoded on the chromosome carrying the defective C7*VL gene (19, 20) (Fig. 9c). Two "half SD" haplotypes have also been observed: 1) In family 4, the segregation of all haplotypes can be deduced from the available data on all the family members. Subject 1.2 has the C6 A + H region characteristic of C6*SD and is heterozygous for C6*QO and (by deduction from her son F4.II.2) the C6 intron 15 boundary defect, but not the C7 region or exon 11 defect (Fig. 9d). She is phenotypically C6 SD. The chromosome was passed to her son (F4.II.2) who has the C6 intron 15 boundary defect and who produces C7 from both chromosomes as he expresses both M and N allotypes. This demonstrates the independence of the C6 and C7 defects inasmuch as the C6 defect does not inhibit C7 production and the lack of the C7 defect does not enhance C6 production (35). 2) Subjects II. 1 and 11.2 of family 6 are heterozygous for the C7 exon 11 defect and appear to have a C7*QO gene on the other chromosome (Fig. 9e). The C6 intron 15 boundary defect is not found. They are phenotypically C7 deficient and produce C6 normally from both genes as they are heterozygous for the C6 A/B allotypes. This demonstrates the independence of the C6 and C7 defects inasmuch as the C7 defect does not inhibit C6 production and this leads to consumption of minimal C7 product (as above). FIGURE 7. Family 6 is a Russian family comprising parents and three children. Two sons, subjects 11.1 and II.2, are C7 deficient with normal C6 levels and were ascertained due to recurrent meningococ-cal infections and were described as patients 14 and 15, kindred 12 (Table I) (17). The existence of two "half haplotypes"' bearing the characteristic molecular defects of C6*SD and C7*SD, respectively, implies that there has been intergenic recombination. We have no way of knowing if the haplotype with both defects was generated first, followed by recombination to isolate them, or if it was synthesized by a fusion of two independently affected genes. We have more cases of the combined deficient haplotype than of the single haplotypes, but the total numbers are small and subject to potentially huge ascertainment artifacts as it would be difficult to detect het-erozygotes of either combined or individual subtotal deficiency with a normal chromosome. Assuming that the defect mutations have happened within pre-existing haplotypes, which have remained otherwise unchanged, the existence of the haplotype elsewhere in a population is a necessary condition for a fusion hypothesis. The C7 haplotype associated with C7*SD has been observed in the Cape colored population group (from which families 3 and 4 are drawn) only once other than with C7*SD, and then with a C6*QO allele. Its frequency in Russia (the origin of family 6) is unknown, and it has been observed twice in the U.K. Hence, we favor the notion of "splitting" recombinations. The C6 marker combination of the C6*SD haplotype is common both in the Western Cape and Britain (35) and thus does not contribute to this argument. Defect Probably Causing C6 Subtotal Deficiency Wild Type exon 15 TLTKLKGHCQLGQKQSGSECICMSPEEDCSer Boundary se r Normal TGT AGq taa ga I Deficient TGT AGq caa gag ata ccc tac aga ctg tgt ctg gaa aat ggg aaa ace agt cta gtg taa с.... ?poly A Arg Gin Glu lie Pro Tyr Arg Leu Cye Leu Glu lie Gly Lye Thr Ser Leu Val *** 17 new amino acids coded in intron, boundary amino acid altered 140 amino acids deleted, plus 1 CHO attachment site 13.5% shorter polypeptide 2 new acidic residues 3 new basic 1 new tyrosine 1 new cysteine replacing 16 acidic 15 basic 4 tyrosine 5 histidine 14 cysteine FIGURE 8. Sequence of the 3' region ofC6 exon 15 and the 5' region of intron 15. Normal and defective sequences are shown, together with the predicted amino acid sequence assuming that there is a failure in splicing. FIGURE 9. Pictorial summary of the combinations of C6 and C7 genes observed in this study. No significance should be drawn from the absence of the combination not so far observed. It would probably present as C7 deficient and will probably be found by investigation of C7-deficient cases using the tools described in this paper. It is possible to advance a selective hypothesis for the existence of combined C6/C7*SD genotypes. Where single deficiencies occur there is a potential for destabilization of the phenotype, as seen in the case of C7 deficiency in F5.II.1, where partial deficiency is converted to total deficiency in adverse circumstances and in F6.II.1 and 11.2, where it appears that the C7 deficit is more profound and the resultant deficiency is constant. The mechanism for this appears to be the production in vivo of C56, either as a normal process (family 6) or provoked by chronic infection (F5.II.1) (19). Where C7 synthesis is normal and C5, C6, and C7 are of broadly similar abundance, the generation of C56 at a site of С activation immediately leads on to incorporation of C7, attachment to a surface (or prompt decay of this activity), and further reaction with C8 and C9. When the synthesis is unbalanced and there is little C7, it is quite probable that active C56 circulates and scavenges any C7 at sites remote from the activation events. The data from family 6 provides strong support for the notion that the deficiency of C7 in F5.II.1 is due to consumption by this mechanism. Where both genes of a chromosome are defective the quantitative consequences are more balanced, leading to possible selective advantage for a defect in the second gene. We do not necessarily subscribe to this last hypothesis. Extrapolating from the present investigation, inherited defects leading to insufficient synthesis in other systems where there is a stoichiometric interaction and consumption of reactants may also present as deficiencies due to complete consumption. In such cases, assays based on the detection of premature terminations in the mRNA may not reveal the defect. The alteration in C7 exon 11 involves the cytosine of a CG dinucleotide, but is not the common С > Т transition, implying that it is not due to instability of a methylated cytosine. The common C6 A/B polymorphism involves a similar change. The C7 12.-27 and C7 M/N polymorphisms are also С > A transversions in different sequence contexts. The intronic C6 Msp\ polymorphism does, however, involve the expected С > Т transition (CCGG > CTGG) (56). 3656 MOLECULAR BASES OF COMBINED SUBTOTAL C6 AND C7 DEFICIENCIES Table II. Haplotypes associated with С deficiencies Population No. Condition Group Haplotype Observed C6*QO Cape colored В - L; LLMA4- 32 В - L; LLMC+ 3 В - L; LHMC+ 4 В - L; HLMA+ 1 А + Н ;ННМА- 1 Combined C6/C7*SD Several А + Н ;ННМА- 7 The defect in the splice donor site of intron 15 of C6 can be predicted to have the effects that are observed: an approximately 15% lower m.w. product and altered isoelectric point. Formal proof of the genotype/phenotype relationship might be had by investigation of the C-terminal sequence of the abnormal protein, but this is of such low abundance that its isolation is very difficult. The identity of C6 phenotype seen where the C6 defect is in isolation from the C7 defect lends strong circumstantial support to the view that the responsible defect has been correctly identified. The altered arginine encoded in C7 exon 11 is in the central thrombospondin repeat unit and is highly conserved at the equivalent location in all terminal components of C. It is at a similar location in thrombospondin domains of other proteins, which is consistent with the possibility that it is functionally important (57). Its replacement with serine causes the different isoelectric point and may well lead to the low serum C7 concentrations seen in C6/C7 SD. It has little effect on the biologic activity of those C7 molecules that do circulate. We offer no suggestion for a mechanism and believe that there is a strong possibility that site-directed mutagenesis and expression experiments would not lead to a resolution of the matter, since we do not know if the low plasma concentrations are due to underproduction or excess catabolism. A reliable result of normal or increased expression by the mutant would indicate the latter, but low expression has many alternative potential causes and could not be interpreted. The important feature of family 6 is that both sons are pheno-typically C7 deficient and are heterozygous for the C7 exon 11 defect alone. Irrespective of their other C7 gene, this strongly implies that the defect is associated with the inability to direct the production of C7 at normal levels. If it is merely a marker for another defect and has no functional consequence in itself, it is a marker that has never been observed in the absence of that defect. Experience with other markers in the region would make that surprising since they are, for the most part, weakly associated (32). We believe that the overall data are sufficient to support the claim that we have discovered the molecular bases of C6 and C7 subtotal deficiency and, in these and previously published observations, uncovered hitherto unrecognized but readily understood effects of deficiency of C6 on C7 levels and vice versa. Acknowledgements The authors thank Valentina A. Ivanova and Galina A. Kovtun for technical assistance. We are grateful to Professor Jim Ward, University College Galway, Galway, Ireland, for transporting samples from our colleagues in Russia. References 1. Abbott, C" L. West, S. Povey, S. Jeremiah, Z. Murad, R. DiScipio, and G. Fey. 1989. The gene for human complement component C9 mapped to chromosome 5 by polymerase chain reaction. Genomics 4:606. 2. Jeremiah, S. J., C. M. Abbott, Z. Murad, S. Povey, H. J. Thomas, E. Solomon, R. DiScipio, and G. H. Fey. 1990. The assignment of the genes coding human complement components C6 and C7 to chromosome 5. Ann. Hum. Genet. 54:141. 3. Rogde, S., 0. Myklebost, J. H. Giving. H. T. Kyrkjebo. R. Jonassen. B. Olaisen, and T. Gedde-Dahl, Jr. 1991. The human genes for complement components 6 (C6) and 9 (C9) are closely linked on chromosome 5. J. Mod. Genet. 28:587. 4. Coto, E., E. Martinez-Navez, 0. Dominguez, R. DiScipio. J. M. Urra, and C. Lopez-Larrea. 1991. DNA polymorphisms and linkage relationship of the human complement component C6, C7 and C9 genes. Immunogenetics 33:184. 5. Hobart, M. J., V. Joysey. and P. J. Lachmann. 1978. Inherited structural variation and linkage relationships of C7. J. Immunogenetics 5:157. 6. Tokunaga, К., G. Dewald, K. Omoto. and T. Juji. 1986. Family study on the polymorphisms of the sixth and seventh components (C6 and C7) of human complement: linkage and haplotype analyses. Am. J. Hum. Genet. 39:414. 7. Rogde, S., B. Olaisen. T. Gedde-Dahl Jr.. and P. Teisberg. 1986. The C8A and C8B loci are closely linked on chromosome 1. Ann. Hum. Genet. 50:139. 8. Rogde, S., T. Gedde-Dahl Jr., P. Teisberg. R. Jonassen. B. Hoyheim, and B. Olaisen. 1992. Linkage and association studies with C8A and C8B RFLPs on chromosome 1. Ann. Hum. Genet. 56:233. 9. Theriault, A., E. Boyd, K. Whaley, J. M. Sodetz, and J. M. Connor. 1992. Regional chromosome assignment of genes encoding the alpha-subunit and beta-subunit of human complement protein-C8 to lp32. Hum. Genet. 88:703. 10. Miiller-Eberhard, H. J. 1986. The membrane attack complex of complement. Annu. Rev. Immunol. 4:503. 11. Lachmann, P. J., and R. A. Thompson. 1970. Reactive lysis: the complement-mediated lysis of unsensitized cells. II. The characterization of activated reactor as C56 and the participation of C8 and C9. J. Exp. Mod. 131:643. 12. Wiirzner, R., A. Orren, and P. J. Lachmann. 1992. Inherited deficiencies of the terminal components of human complement. lmmunodeficienc\ Rev. 3:123. 13. Lachmann, P. J., M. J. Hobart, and P. Woo. 1978. Combined genetic deficiency of C6 and C7 in man. Clin. Exp. Immunol. 33:193. 14. Morgan, B. P., J. P. Vora, A. J. Bennett. J. P. Thomas, and N. Matthews. 1989. A case of hereditary combined deficiency of complement components C6 and C7 in man. Clin. Exp. Immunol. 75:396. 15. Orren, A., R. Wiirzner, P. C. Potter, B. A. Femie, S. Coetzee. B. P. Morgan, and P. J. Lachmann. 1992. Properties of a low molecular weight complement component C6 found in human subjects with subtotal C6 deficiency. Immunology 75:10. 16. Wiirzner, R., A. Orren. P. Potter, B. P. Morgan. D. Ponard. P. Spain. M. Brai, M. Schuize, L. Happe. and 0. Gotze. 1991. Functionally active complement proteins C6 and C7 detected in C6- or C7-deficient individuals. Clin. Exp. Immunol. 83:430. 17. Platonov, A. E., V. B. Beloborodov. and I. V. Vershinina. 1993. Meningococcal disease in patients with late complement component deficiency: studies in the USSR. Medicine 72:374. 18. Platonov, A. E., V. B. Beloborodov, D. I. Gabrilovitch. V. V. Khabarova, and L. V. Serebtovskaya. 1992. Immunological evaluation of late complement component deficient individuals. Clin. Immunol. Immunoputhol. 64:98. 19. Platonov, A. E., R. Wiirzner, V. B. Beloborodov, A. M. Jones. D. V. Troshansky, I. V. Vershinina, P. J. Lachmann, and A. Orren. 1994. Paradoxical reconstitution of complement activity following plasma transfusion of an individual with deficiency of the seventh component of complement. Immunology 81:142. 20. Wiirzner, R., A. E. Platonov, V. B. Beloborodov, A. I. Pereverzev, I. V. Vershinina, B. A. Femie, M. J. Hobart, P. J. Lachmann, and A. Orren. 1996. How partial C7 deficiency with chronic and recurrent bacterial infections can mimic total C7 deficiency: temporary restoration of host C7 level following plasma transfusion. Immunology. 88:407. 21. Thompson, R. A., and D. S. Rowe. 1968. Reactive haemolysis-a distinctive form of red cell lysis. Immunology 14:745. 22. Hobart, M. J., B. A. Femie, and R. G. DiScipio. 1993. Structure of the human C6 gene. Biochemistry 32:6198. 23. Setien, F., V. Alvarez, E. Coto, R. G. DiScipio, and C. Lopez-Larrea. 1993. A physical map of the human complement component C6. C7 and C9 genes. 1m-munogenetics 38:341. 24. Hobart, M. J., B. A. Femie, R. G. DiScipio. and P. J. Lachmann. 1993. A large-scale molecular map of the C6 and C7 complement component gene region on chromosome 5pl3. Hum. Molec. Genet. 2:1035. 25. Hobart, M. J., B. A. Femie, and R. G. DiScipio. 1995. Structure of the human C7 gene and comparison with the C6, C8A, C8B and C9 genes. J. Immunol. 154:5188. 26. Coto, E., E. Martinez-Naves, 0. Dominguez, J. M. Urra. V. Rodriguez, and C. Lopez-Larrea. 1990. Taq\ polymorphism in the complement component C7 gene. Nucleic Acids Res. 18:1929. 27. Coto, E., 0. Dominguez, E. Martinez-Naves, F. Setien. V. Gutierrez, and C. Lopez-Larrea. 1991. Mspl polymorphism at the human complement component C6 gene (C6). Nucleic Acids Res. 19:194. 28. Potter, P. C., C. Warburton, R. Wiirzner. A. On-en, and R. G. DiScipio. 1993. Association of a 12.5-kilobase allele of the Mspl restriction fragment length polymorphism of the C6 gene in patients with total deficiency of the sixth component of complement. Exp. Clin. Immunogenet. 10:38. 29. Femie, B. A., G. Delbridge, and M. J. Hobart. 1993. Correlation of a Glu/Ala substitution at position 98 with the complement C6 A/B phenotypes. Hum. Molec. Genet. 2:591. 30. Dewald, G., M. M. Nothen, and S. Cichon. 1993. Polymorphism of human complement component C6: amino acid substitution (Glu/Ala) within the second thrombospondin repeat differentiates between the two common allotypes C6 A and C6 B. Biochem. Biophys. Res. Comm. 194:458. 31. Wiirzner, R., B. A. Femie, M. J. Hobart, A. Orren, and P. J. Lachmann. 1993. The C7M/N polymorphism is determined by a neutral amino acid substitution outside the epitope of the allospecific monoclonal antibody WLJ 4-15. Mol. Immunol. 30 (Suppl. 1):63 (Abstr.). 32. Fernie, B. A., R. Wurzner, D. J. Unsworth. R. I. Tuxworth, and M. J. Hobart. 1995. DNA Polymorphisms of the complement C6 and C7 genes. Ann. Hum. Genet. 59:163. 33. Femie, В. A., R. Wurzner, A. Orren, and M. J. Hobart. 1996. A new intronic polymorphism in the C7 gene 36 bp from the common expressed C7 M/N polymorphism. Ann. Hum. Genet. 60:179. 34. Wurzner, R.. B. A. Femie, A. M. Jones, P. J. Lachmann, and M. J. Hobart. 1995. Molecular basis of the complement M/N polymorphism: a neutral amino acid substitution outside the epitope of the allospecific monoclonal antibody WU 4-15. J. Immunol. 154:4813. 35. Fernie, B. A., A. Orren, R. Wurzner, A. M. Jones, P. C. Potter, P. J. Lachmann, and M. J. Hobart. 1995. Complement component C6 and C7 haploiypes associated with deficiencies of C6. Ann. Hum. Genet. 59:183. 36. Lopez-Larrea, С., О. Dominguez. E. Martinez-Naves, and E. Coto. 1990. Study of genetic polymorphism of seventh complement component in two families with hereditary deficit. Complement Inflamm. 7:90. 37. Alvarez, A., E. Coto, F. Setien, P. Spath. and C. Lopez-Larrea. 1995. Genetic detection of the silent allele (*QO) in hereditary deficiencies of the human complement C6, C7 and C9 components. Am. J. Med. Genet. 55:408. 38. Wurzner, R., N. Ranee, P. C. Potter, M. L. Hendricks, P. J. Lachmann, and A. Orren. 1992. C7 M/N protein polymorphism typing applied to inherited deficiencies of human complement proteins C6 and C7. Clin. E.\p. Immunol. 89:485. 39. Fernie, B. A., M. J. Hobart, G. Delbridge. P. C. Potter. A. Orren. and P. J. Lachmann. 1994. C6 haplotypes: associations of a Dde\ site polymorphism to complement deficiency genes and the Msp\ restriction fragment length polymorphism (RFLP). Clin. Exp. Immunol. 95:351. 40. Hobart, M. J., B. A. Femie, R. Wurzner, B. P. Morgan, and P. J. Lachmann. 1993. Molecular basis of combined C6 and C7 deficiency: C6. Mol. Immunol. 30 (Suppl. 1):16 (Abstr.). 41. Wurzner, R., D. Mewar, and P. J. Lachmann. 1993. The dysmorphic but functionally active C6 of subtotal C6 deficient subjects is carboxyterminally truncated. Mol. Immunol. 30 (Suppl. 1):63 (Ahstr.). 42. Wurzner, R.. M. J. Hobart, B. A. Femie, D. Mewar, P. C. Potter, A. Orren, and P. J. Lachmann. 1995. Molecular basis of subtotal complement component C6 deficiency. A carboxy-terminally truncated but functionally active C6. J. Clin. Invest. 95:1877. 43. On-en, A., R. Wurzner, P. J. Lachmann. and M. J. Hobart. 1994. A novel human complement component C7 phenotype detected in South Africa and proposed designation of the allele as C7*10. Eur. J. Immunogenet. 21:181. 44. Jeffreys, A. J. 1979. DNA sequence variants in the G-y-, Ay- and b- and /3-globin genes in man. Cell 18:1. 45. Fowke, К. R., F. A. Plummer, and J. N. Simonsen. 1995. Genetic analysis of human DNA recovered from minute amounts of serum or plasma. J. Immunol. Methods 180:45. 46. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel. S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Eriich. 1988. Primer-directed enzymic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science 239:487. 47. Southern, E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503. 48. Sambrook, K., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 49. Laskey, R. A., and A. D. Mills. 1977. Enhanced autoradiographic detection of32? and 125! using intensifying screens and hypersensitized film. FEBS Lett. 82:314. 50. Newton, C. R., A. Graham, L. E. Heptinstall, S. J. Powell, C. Summers, N. Kalsheker, J. C. Smith, and A. F. Markham. 1989. Analysis of any point mutation in DNA: the amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids. Res. 17:2503. 51. Sanger, F., S. Nicklen, and A. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463. 52. DiScipio, R. G., D. N. Chakravarti, H. J. Muller-Eberhard, and G. H. Fey. 1988. The structure of human complement component C7 and the C5b-7 complex. J. Biol. Chem. 263:549. 53. Nakamura, S., 0. Ooue, and K. Abe. 1984. Genetic polymorphism of the seventh component of complement in a Japanese population. Hum. Genet. 66:279. 54. York, L. J., W. H. Marshall, and S. N. Huang. 1986. Polymorphism of the seventh complement component, C7, in Chinese. Hum. Hered. 36:261. 55. Nishimukai, H., and Y. Tamaki. 1986. Genetic polymorphism of the seventh component of complement: a new variant. Vox Sang. 51:60. 56. Fernie, B. A., A. Finlay, D. Price, E. Chan, A. Orren, V. C. Joysey, K. A. Joysey, and M. J. Hobart. 1996. Complement C6 and C7 DNA polymorphisms analysed by PCR in seven ethnic groups and characterisation of the C6 Msp\ RFLP. Exp. Clin. Immunogenetics. In press. 57. Wurzner, R., D. Mewar, B. A. Fernie, M. J. Hobart, and P. J. Lachmann. 1995. Importance of the third thrombospondin repeat of C6 for terminal complement complex assembly. Immunology 85:214. Molecular Immunopathology Unit, Medical Research Council Center, Cambridge, United Kingdom Received for publication May 15,1996. Accepted for publication July 31,1996. The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article rnua therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.С. Section 1734 solely to indicate this fact. 1 This work was supported in part by Grant WU165/2-1 from the Oeutsche For-schungsgemeinschaft (to R.W.); a grant from the Deutsche Akademische Aus-tauschdienst, Bonn, Germany (to R.W.); a grant from the Arthritis and Rheumatism Council, Chesterfield, U.K. (to R.W.); a grant from The Meningitis Trust, Stroud, U.K. (to A.O.); Grants N44000/N44300 from the International Science Foundation and Grant 1010-CT93-0011 from INTAS (International Association for the Promotion of Cooperation with Scientists from the Independent States of the former Soviet Union) (to A-?-P.). 2 Current address: Institut fur Hygiene, University of Innsbruck. Fritz-Pregl-Str. 3, A-6020, Innsbruck, Austria. 3 В.P.M. was a Wellcome Senior Research Fellow at the time of this investigation. Current address: Dept. of Medical Biochemistry, University of Wales College of Medicine, Heath Park, Cardiff, Wales. 4 Current address: Dept. of Clinical Science and Immunology, University of Cape Town, Observatory, Cape Town, Republic of South Africa. 5 Current address: Central Institute of Epidemiology, Noyogireevskaya st. За, Moscow 111123, Russia. 6 Address correspondence and reprint requests to Dr. Michael). Hobart, Molecular Immunopathology Unit, Medical Research Council Centre, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, U.K. 7 Abbreviations used in this paper: C6/C7 SD, combined subtotal deficiency of C6 and C7; C6 SD, C7 SD, isolated subtotal deficiency of either C6 or 1.7;C6/C7-SD, C6*SD, C7*SD, alleles for the above; C6-QO, C7*QO, alleles for C6 or C7 deficiency (total deficiency); C7*VL, an allele for very low expression of C7; C6 A/B, C6 isoelectric focusing allotypes or DNA equivalent; C7 M/N, C7 epitope availability allotypes or DNA equivalent; kbp, 103 base pairs. Article 12.htm PCR-BASED ASSAY FOR CONFIRMATION AND IDENTIFICATION OF SEROGROUP A, B AND С MENINGOCOCCAL DISEASE. 1Shipulin G.A.,2 Tyntyunnik E.N., 1Shipulшa O.J., 1Koroleva I.S., 2Vengerov JuJa, 1PlatonovA.E. 1Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia;2Moscow Institute of Medicine and Dentistry, Russia. Non-culture methods to diagnose the meningococcal infection are vital at a time when the number of culture confirmed cases is low due to wide preclinical use of antibiotics. A lot of polymerase chain reaction (PCR) assays have been proposed for the direct detection of neisseria from clinical samples [1-3]. These assays have to be supplemented by PCR-based approaches for classification (grouping, typing, and subtyping) of causative agent, that is important for epidemic surveillance and vaccination strategy. As far as group A, B, and С meningococci are responsible for most cases of systemic meningococcal disease in Russia (for about 40%, 40% and 15%, correspondingly [4]), we have developed in me first instance the specific PCR assay to make out these serogroups. The targets of specific primers were the unique gene coding UDP-N-acety1-D-glucosamine 2-epimerase [5] for serogroup A and the sialykransferase (siaD) gene [3] for serogroup В and С meningococci. To discriminate between serogroup B, C, W135 and Y, the latter primers had at least 4-5 mismatches with the non-homologous sequences ofsiaD. Using the DNA extracted from meningococci the conditions of amplification were chosen, the sensitivity and specificity of primers was checked, and the detection limit of assay was determined. The strains were isolated from patients with systemic meningococcal disease in Moscow (60 strains) and the Netherlands (32 strains), belonged to serogroup A, B, and С (35, 47, and 10 strains, correspondingly), and had various MLST and MLEE types, serotype and subtype antigens. In the model conditions the assay was able to detect at least 10 genomic copies of meningococci; the serogroup of all strains was classified correctly by PCR, that is the sensitivity and specificity was 100%. Then the same assay was applied to the CSF samples obtained from 56 patients with meningococcal disease. The serogroup of causative agent was determined either by culture (23 samples), or latex agglutination test (20 samples), or both (13 samples). In all CSF samples the presence of neisserial DNA was confirmed by genus-specific PCR for I6S rRNA gene [1,2]. The serogroup-specific PCR was positive and coincided with the data of culture and latex test (true positive results) in 53 CSF samples (21, 24, and 8 samples from patients with group A, B and С meningococcal disease, correspondingly). The serogroup-specific А, В, С PCR assays were negative in one CSF sample obtained from patient with disease caused by W135 strain (true negative result) and in one CSF sample from patient with group В disease (false negative result). One CSF sample obtained from patient with disease caused by group С strain was positive for serogroup A specific PCR (false positive and false negative result). So, in total, serogroup-specific PCR assay using patient CSF samples have demonstrated the sensitivity of 98% and specificity of 99%. The serogroup A, B, C specific PCR is a useful and cost-effective addition to currently available methods for culture and non-culture diagnosis of meningococcal infection and outbreak investigation [2,3]. References 1. Radstrom P, Backman A, Qian N, et al. Detection of bacterial DNA in cerebrospinal fluid by an assay for simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and streptococci using a seminested PCR strategy. JClin Microbiol 1994; 32: 2738-44. 2. Platonov AE, Shipulin GA, Koroleva IS, Shipulina OJ. prospects to diagnose bacterial meningitis.] Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 1999; ? 2: 71-6 (in Russian). 3. Borrow R, Claus H, Guiver M, et al. Non-culture diagnosis and serogroup determination of meningococcal В and С infection by a sialyteransferase (siaD) PCR ELISA. Epidemiol Infect 1997; 118:111-7. 4. Koroleva I.S., Platonov A.E., van der Ende A., Kuijper E., Dankert J. Characteristics of pathogenic N.menmgitidis in Moscow: Prevalence of "non-European" strains. Clin Microb Infection 1998; 4: 123-8. 5. Swartley JS, Liu U, Miller YK, Martin LE, Edupuganti S, Stephens DS. Characterization of the gene cassette required for biosynthesis of the (alpha 1->6)-linked N-acetyl-D-mannosamine-1-phosphate capsule of serogroup ANeisseria meningitidis. J Bacterial 1998; 180: 1533-9. Article 13.htm Meningococcal disease and polymorphism of Fc7RIIa (CD32) in late complement component-deficient individuals A. E. PLATONOV, E. J. KUIJPER*, I. V. VERSHININA, G. A. SH1PULIN, N. WESTERDAAL^, C. A. P. FIJEN* & J. G. J. VAN DE WINKEL^^^ Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia, *Department of Medical Microbiology, WHO Reference Laboratory for Bacterial Meningitis, The University of Amsterdam and Academic Medical Centre, Amsterdam, ^Department of Immunology and ^^Medarex Europe, University Hospital Utrecht, Utrecht, The Netherlands (Accepted for publication 9 October 1997) SUMMARY Late complement component-deficient (LCCD) individuals lack plasma bactericidal activity and are highly susceptible to meningococcal disease. Phagocytosis plays a significant role in immune defence against meningococci and involves Fc7RIIa (CD32) on leucocytes. Two allotypic forms are currently recognized: Fc7RIIa-R131 and RIIa-H131. Neutrophils with the IIa-H/H131 allotype are more effective in phagocytosis than IIa-R/R131. We studied the distributions of IIa-R131 and lla-H131 allotypes among 29 Russian LCCD patients who had suffered from recurrent episodes of meningococcal disease. The distribution of IIa-R/R131 to heterozygous IIa-R/H131 to homozygous IIa-H/H131 genotypes was 0-14:0-29:0-57 for LCCD patients who developed the first episode of disease before 10 years of age. The distribution was 0-21:0-64:0-14 for patients who experienced meningococcal disease above the age of 10 years (^=6, P<0-05, odds ratio for Па Н/Н131 versus R/R131 =8). Meningococcal disease had a 'grave' course in 14 of 31 disease episodes in patients with IIa-R/R131 and IIa-R/H131 allotypes, in contrast to 1 of 18 episodes in patients with IIa-H/H131 allotype (\2=^, P<0-01, odds ratio = 14). We conclude that IIa-H/H131 individuals appear to have a higher acquired antibody-mediated phagocy-tosis-dependent resistance to meningococcal disease above the age of 10 years. Additionally, effective CD32-mediated phagocytosis may restrict the severity of meningococcal disease in LCCD patients with IIa-H/H131 phenotype. Keywords FcgRIIa meningococcal infection complement deficiency INTRODUCTION Late complement component-deficient (LCCD) individuals lack one of the 'late' or 'terminal' components (from C5 to C9) and plasma bactericidal activity [1,2]; they are approximately a thousand times more susceptible to meningococcal disease than complement-sufficient individuals [2,3]. LCCD individuals differ in the susceptibility to develop meningococcal disease, suggesting that some form of protective immunity can develop either by an efficient phagocytic killing [2,4] or by an antibody-dependent cellular cytotoxicity to meningococcal infected cells [5]. Vaccination of LCCD patients with tetravalent capsular polysaccharides resulted in an increase of phagocytic capacity and a protective effect against recurrent meningococcal diseases [6]. However, the effectiveness of meningococcal phagocytosis depends significantly on the allotype of IgG Fc receptors on phagocytes [7]. Three major classes of leucocyte Fc7R exist in humans: Fc7RI (CD64), FC7RII (CD32) and FC7RIII (CD 16) [8]. The latter two classes are constitutively expressed on neutrophils as Fc7RIIa and Fc7RIIIb and exhibit structural and functional polymorphisms. Both receptors can bind human IgGI and IgG3 subclasses, but Fc7RIIa represents the sole leucocyte FcR capable of binding IgG2 [9,10]. Two allotypic forms of Fc7RIIa are known, designated Fc7RIIa-R131 and Fc7RIIa-H131, because of the presence of an arginine or a histidine at position 131 in the extracellular domain of the receptor [8,10]. Neutrophils from homozygous IIa-R/R131 donors are less effective than IIa-H/H131 neutrophils, and heterozygous neutrophils exhibit intermediate levels of phagocytosis of meningococci [7]. We hypothesized LCCD patients with Fc7RIIa-R/R131 to be more susceptible to meningococcal disease than IIa-H/H131 and IIa-R/H131 allotypes. The objective of the present study was to allotype Fc7RIIa-R131 and IIa-H131 amongst 29 Russian LCCD patients with a history of meningococcal disease. PATIENTS AND METHODS LCCD patients Twenty-nine Slavic LCCD patients (19 males, 10 females) were studied [3]. The lacking complement component was identified by functional, antigenic and genetic methods. Of 28 patients with an inherited deficiency of C8)3 subunit, 25 had homozygous C-T exchange in exon 9 (position 1309), leading to a stop codon, two had this mutation in heterozygous state and an analogous mutation in exon 3, and one had a mutation not identified yet [II]. The remaining patient had a constitutively total C7 component deficiency at the phenotypic level that, however, might be a genetically subtotal C7 deficiency [12]. This patient having H/H131 genotype had experienced one episode of meningococcal disease at an age of 6 years. In so far as our previous studies had not revealed any difference between C8/3- and C7-deficient individuals in immune-logical parameters, the frequency and clinical presentation of meningococcal disease, and immune response to vaccination [3,13,14], the data on C8- and C7-deficient patients were combined to yield a single set of data. The patients, their immune state and molecular basis for complement deficiency, the history of their previous episodes of meningococcal disease have previously been described in detail [3,11-14]; patients 1-5, 8, 17, 19-20, 22-27, 29-41, and 45 from the general list of LCCD individuals in Russia [3,11] were recruited in this study. Of 29 LCCD patients, nine experienced one meningococcal episode, 10 two episodes, four three episodes, three four episodes, and two five episodes; one individual, no. 45, did not contract meningococcal disease until the age of 42 years. All of them were healthy at the time of this study and participated upon informed consent. The control group consisted of 107 healthy Slavic adult donors. Diagnosis of meningococcal disease in LCCD patients and estimation of its severity Twenty-nine LCCD patients experienced in total 63 episodes of systemic meningococcal disease between 1961 and 1994. Analysis of the patients' clinical diagnoses and severity of disease was performed retrospectively and based on information obtained by the treating physicians using standard and complete case records and discharge letters. Diagnosis of meningococcal infection was confirmed by bacterial culture in 14 episodes (four serogroup A, five serogroup B, one serogroup C, one serogroup W135, one serogroup Y, and two ungroupable isolates of meningococci), by positive meningococcal antigen test or positive specific meningococcal polymerase chain reaction (PCR) [15] of cerebrospinal fluid (CSF) in 2] episodes, and by the presence of Gram-negative diplococci on direct microscopy of the CSF or blood in 19 episodes. In 10 episodes, the diagnosis was based on the typical clinical syndrome only [16,17]. Laboratory tests for the presence of other bacterial pathogens of bacterial meningitis (Streptococcus pneumo-niae, Haemophilus influenwe) were negative in all patients. Two grades of severity were used to classify episodes of meningococcal disease [3]: A. Grave meningococcal disease with at least one of the following items: (i) coma; (ii) shock defined and graded according to Martin & Silverman [18], including tachypnoea, tachycardia, inadequate organ perfusion with one or more of the following symptoms: hypoxaemia, oligouria, acute alteration of the mental status and hypotension; (iii) necrotic skin lesions requiring surgery; (iv) focal neurologic signs; (v) long-term complications (e.g. neurological sequelae, arthritis, or endocarditis); (vi) an unresolved infection as demonstrated by a second lumbar puncture performed on day 10. В. Moderate case were all other cases of systemic meningococcal disease, which were not scored as grave (or lethal). Blood samples and DNA extraction Blood specimens of 1 ml were collected by venipuncture into EDTA-containing tubes. DNA was isolated and extracted by the method of Boom et al. [19]. Purified DNA was stored in distilled water with sodium acetate 0-3 тм and isopropanol 50% at -20°C until testing. Determination of FcgRIIa-R131 and JIa-H13l genotypes FcgRIIa allotypes were determined on genomic DNA, derived from peripheral blood leucocytes, by allele-specific oligo-nucleotide hybridization with FcgRIIa-R131- and IIa-H131-specific oligonucleotides [20]. Statistical analysis All statistical analyses and tests were performed by using SPSS 6.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Numerical variables, e.g. the age of patients, were compared using the Mann-Whitney [/-test for non-parametric data: P <0*05 was considered statistically significant. The \2 criterion was used to compare the distributions of discrete variables, e.g. the severity of disease in the groups of patients with different Fc^RIIa allotypes. RESULTS FcgRIIa allotypes and susceptibility to meningococcal disease The distribution of FcgRIIa-R/R131, IIa-R/H131 and IIa-H/H131 allotypes in 29 Slavic LCCD patients was 17%:45%:38%, which was not different from distribution in 107 Slavic complement-sufficient healthy donors of 18%:54%:28% (P=0-6). The median number of meningococcal disease episodes per individual was 2 in the three different allotyped subgroups of LCCD patients. The age distribution at the moment of meningococcal infection, especial* at first episode of disease, was shifted to the young ages in trr^ subgroup of patients having IIa-H/H131 genotype, and vice versa, shifted to older ages for the IIa-R/R131 patients (Fig. 1). The median age at the first and recurrent episodes in LCCD patients with IIa-H/H 131 allotype was significantly lower than in the other two allotypes (P<0-05, Mann-Whitney test). The median age at first episode of meningococcal disease was 17 years for LCCD patients with IIa-R/R131 allotype, 16 years for IIa-R/H 131 allotype and 6 years for patients with IIa-H/H131 allotype. Correspondingly, the median age at recurrent episodes of disease was 21 years for LCCD IIa-R/R131 patients, 23 years for IIa-R/H131 and 13 years for IIa-H/H131 allotype. The episodes of meningococcal disease in LCCD patients are categorized in episodes occurring at ages ^ 10 years (n = 22) ('children') and in episodes occurring at ages > 10 years (n=41) ('adults'). The frequency distributions of Fc7RIIa allotypes observed in children and adults, the relevant odds ratios, \~ and P values for comparison of different subgroups are given in Table 1, rows 2-5. When the relative risk was assessed of LCCD patients with IIa-R/R131 or IIa-R/H131 allotypes contracting meningococcal disease for the first time aged > 10 years, it was 3-3 times higher compared with IIa-H/H131 patients (95% confidence interval = 1-01-12). The relative risk of patients with IIa-R/R131 or IIa-R/H131 allotypes experiencing recurrent infection aged 2: 10 years was 2-0 times higher than in IIa-H/H131 patients (95% confidence interval = 1-1-3-8). Fig. 1. Age dependence of meningococcal disease episodes in late complement component-deficient patients of different FcgRIIa allotypes. , black- R/R131 ;grayed-R/H131;white- H/H131. FcgRIIa allotypes and severity of meningococcal disease Of 63 episodes of meningococcal disease in 29 LCCD patients, 49 episodes were documented sufficiently to allow classification as 'grave' or 'moderate' disease. There was a strong association between the severity of meningococcal disease in LCCD patients and the Pc7RIIa allotype (Fig. 2). Of 18 episodes in LCCD patients with IIa-H/H131 allotype, 17 were defined as 'moderate', whereas the disease was defined as 'grave' in 14 of 31 episodes in IIa-R/R131 or IIa-R/H131 patients (P<0-01, odds ratio = 14). This effect was most pronounced for disease episodes in patients above lO years old when all IIa-H/H131 patients had moderate disease episodes (n = 7) only; in contrast, 12 of 25 episodes in IIa-R/R131 or IIa-R/H131 patients were grave (P<0-05, odds ratio > 15). At ages и lOyears, IIa-H/H131 patients had moderate disease in 10 of 11 episodes, whereas two of six episodes in IIa-R/R131 or IIa-R/H131 patients were grave (P=0-2, odds ratio =5). Two cases of reversible septic shock and two cases of brain oedema were observed in the subgroup of patients with IIa-R/R 131 or IIa-R/H131 allotype, whereas no such complications were recorded in IIa-H/H131 patients. Fig. 2. Severity of meningococcal disease in late complement component-deficient patients in relation to FcgRIIa allotypes. white - Moderate; black - grave. Table 1. The distributions of FcgRIIa-R 131 and IIa-H131 allotypes among 29 Slavic patients with late complement component deficiency (LCCD) Subgroup of patients or their meningococcal disease (MD) episodes (number of patients or episodes in subgroups is given in parentheses) Frequency of allotypes X2 and P values for the significance of difference* Odds ratio, value and 95% confidence interval (in parentheses)** R/R131 homozygotes R/H131 heterozygotes Н/Н131 homozygotes 1. All patients with LCCD included in this study (n = 29) 17% (5) 45% (13) 38% (11) 2. From them (row 1): patients experiencing first episodes of MD at age <= 10 years (n=14) 14% (2) 29% (4) 57% (8) 3. From them (row 10): patients experiencing first episodes of MD at age >10 years (n=14)*** 21% (3) 64% (9) 14%(2) In comparison with row 2: x2=6*0, P<0*05 8*0 (1*3-50) 4. All episodes of MD occurring at age <=10 years; one allotype is corresponding to one episode (22 episodes) 9% (2) 27% (6) 64% (14) 5. All episodes of MD occurring at age >10 years; one allotype is corresponding to one episode (41 epsodes) 15% (6) 56% (23) 29% (12) In comparison with row 4: x2 = 7*0, P<0*03 4*2 (1*4-13) * According to Pearson statistics. ** Value of odds ratio > 1 means that the ratio of R/R131 allotypes frequency in this subgroup is greater yhan similar ratio in the subgroup of comparison. *** One individual with H/H131 has not had MD episodes and has been excluded from this analysis. DISCUSSION Meningococci invading the intravascular compartment encounter circulating antibodies, complement and phagocytes. Antibody-mediated lysis of meningococci via classical pathway activation, considered the cornerstone in the immune defence against meningococcal disease, is absent in patients with deficiencies of late complement components (LCCD). In these latter patients, antibody-mediated phagocytic activity may constitute a vital defense mechanism against meningococci, and allotypes of FcgRIIa may thus affect the susceptibility to meningococcal disease. The results of the present study in 29 LCCD patients support Fc7RIIa allotypes to constitute an important element in immunity against meningococcal disease. Russian LCCD individuals with IIa-R/R131 and IIa-R/H131 differed significantly in age dependency and severity of meningococcal disease compared with IIa-H/H131 patients. IIa-H/H131 individuals were affected mainly at young age (< 10 years), whereas the incidence of meningococcal disease in IIa-R/H131 and IIa-R/R131 individuals was higher, > 15 years old. This age dependence parallels the nasopharyngeal carrier rate of meningococci in the general population, which is low in childhood but increases in young adults [21]. For complement-sufficient hosts, the incidence of meningococcal disease is highest in early childhood (1 month to 1 year) and then decreases steadily with a small second peak in the 15-19years interval [22]. The age-dependent decline of incidence is usually explained by the development of rising levels of meningococcal antibodies in time [23]. On the basis of our observations, we propose LCCD individuals with IIa-R/R 131 genotype to be unable to efficiently use anti-meningococcal antibodies for their protection. LCCD individuals with IIa-H/H131 allotype might have acquired partial antibody-mediated immunity to meningococcal disease at an older age. Both in complement-deficient and in complement-sufficient patients, the influence of Fc7RIIa allotypes was less evident/negligible in infants (< 5-10 years), probably attributable to insufficient specific antibodies, especially of the IgG2 isotype [23,24]. Since the class IIa IgG receptors have a particular capacity to interact with IgG2 antibodies, this phenomenon indirectly supports the importance of IgG2-mediated phagocytosis of meningococci for protection of LCCD individuals [25-27]. Quantitatively our study demonstrates the relative but not absolute impact of Fc-y allotypes. Most of our LCCD patients were probands found by special screening of patients with meningococcal disease. Their direct comparison with the group of complement-sufficient healthy donors would not be methodologically correct. The evaluation of allotype distribution among LCCD individuals without meningococcal disease could provide the absolute values of risks associated with Fc7 allotypes, but such Russian LCCD individuals were not available. Other findings supporting the influence of Fc7 allotypes on susceptibility to meningococcal disease were derived from experimental and clinical data [7,25-27]. We previously noted that efficient killing of meningococci by neutrophils in LCCD serum depends on the level of specific complement-activating meningococcal IgG and IgM antibodies [27]. It is hypothesized that maximal killing of meningococci by neutrophils under physiological conditions is achieved by cooperation ofCR3 (CD1 Ib, CD18) complement receptor and Fc receptors [28]. The increased killing capacity of neutrophils upon vaccination of LCCD patients with meningococcal capsular polysaccharide vaccine is paralleled by increase of specific antibody levels [4,27,29,30], and further evaluation of the IgG subclass-specific antibodies involved is underway. This mechanism may be responsible for the protective efficacy of vaccination, observed in our long-term trial [6,14]. Results from a previous study on the severity of meningococcal disease in Russian complement-deficient individuals showed that less severe disease predominated in LCCD patients in comparison with complement-sufficient hosts and that fatal episodes were absent in the LCCD group [3]. The severity of disease was not associated with the type of complement deficiency (C7 or C8 component lacking), the serogroup of infecting meningococci, or the number of recurrent episodes [3]. However, effective CD32-mediated phagocytosis seems to restrict the severity of meningococcal disease in LCCD patients with IIa-H/H131 genotype. It is well documented that severity of meningococcal disease depends primarily on the bacterial lipopolysaccharide (LPS) concentration in the patient's blood and, to some extent, the CSF [17]. The present data support the notion that efficient Fc7RIIa-depei dent phagocytosis in LCCD patients with IIa-H/H131 genotype may limit the multiplication of meningococci in such patients and hence the release of meningococcal LPS-endotoxin. This concept of Fc7RIIa polymorphism and susceptibility of LCCD individuals to meningococcal infections may have implications for future vaccination programmes of this patient group. Up until now, mainly IgG2-inducing capsular meningococcal polysaccharides have been used as vaccine components, but combined vaccines with polysaccharides and proteins are able to induce specific antibodies of different IgG subclasses, and may give better and prolonged protection. ACKNOWLEDGMENTS We are grateful to T. de Wit, 0. Ju. Shipulina, V. A. Ivanova, and G. A. Kovtun for helpful technical assistance. The research was made possible in part by a Grant 1010-CT93-0011 from the INTAS (International Association for the Promotion of Co-operation with Scientists from the Independent States of the Former Soviet Union). REFERENCES 1 Esser AE. The membrane attack complex of complement. Assembly, structure and cytotoxic activity. Toxicol 1994; 87:229-47. 2 Figueroa JE, Densen P. Infectious diseases associated with complement deficiencies. Clin Microbiol Rev 1991; 4:359-95. 3 Platonov AE, Beloborodov VB, Vershinina IV. Meningococcal disease in patients with late complement components deficiency: studies in the USSR. Med (Baltimore) 1993; 72:374-92. 4 Andreoni J, Kayhty H, Densen P. Vaccination and the role of capsular polysaccharide antibody in prevention of recurrent meningococcal disease in late complement component-deficient individuals. J Infect Dis 1993; 168:227-31. 5 Lowell GH, Smith LH, Griffiss JM, Brandt BL, MacDermott RP. Antibody-dependent mononuclear cell mediated antimeningococcal activity. Comparison on the effects of convalescent and postimmuniza-tion immunoglobulins G, M, and A. J Clin Invest 1980; 66:260-7. 6 Platonov AE, Vershinina IV, Dankert J, Kuijper EJ, Gustafson L, Kayhty H. Long-term follow-up of late complement component deficient patients vaccinated with meningococcal polysaccharide vaccine: antibody persistence and efficacy of vaccination. In: Zollinger WD etal., eds. Pathogenic Neisseria 1996:235-6. 7 Bredius RGM, Derkx ВНЕ, Fijen CAP et al. Fc-y receptor IIa (CD32) polymorphism in fulminant meningococcal septic shock in children. J Infect Dis 1994; 170:848-53. 8 van de Winkel JGJ, Capel PJA. Human IgG Fc receptor heterogeneity: molecular and clinical implications. Immunol Today 1993; 14:215-21. 9 Parren PWHI, Warmerdam РАМ, Boeije LCM et al. On the interaction of IgG subclasses with the low affinity Fc-yRIIa (CD32) on human monocytes, neutrophils, and platelets. Analysis of a functional polymorphism to human IgG2. J Clin Invest 1992; 90:1537-46. 10 van Warmerdam РАМ, de Winkel JGJ, Vlug A, Westerdaal NA, Capel PJ. A single amino acid in the second IgG-like domain of the human Fc7 receptor [1 is critical for human IgG2 binding. J Immunol 1991; 147:1338-43. 11 Saucedo L, Ackermann L, Platonov AE, Gewurz A, Rakita R, Densen P. Delineation of additional genetic bases for C8 beta deficiency: prevalence of null alleles and predominance of C-T exchange in their genesis. J Immunol 1995; 155:5022-8. 12 Wiirzner R, Platonov AE, Beloborodov VB et al. How partial C7 deficiency with chronic and recurrent bacterial infections can mimic total C7 deficiency: temporary restoration of host C7 level following plasma transfusion. Immunol 1996; 88:407-11. КЗ Platonov AE, Beloborodov VB, Gabrilovitch DI, Khabarova VV, W Serebrovskaya LV. Immunological evaluation of late complement component-deficient individuals. Clin Immunol Immunopathol 1992; 64:98-105. 14 Platonov AE, Beloborodov VB, Pavlova LI, Vershinina IV, Kayhty H. Vaccination of patients deficient in a late complement component with tetravalent meningococcal capsular polysaccharide vaccine. Clin Exp Immunol 1995; 100:32-39. 15 Platonov AE, Koroleva IS, Shipulin GA, Shipulina OJ, Vershinina IV, Dankert J. Comparison of different methods to diagnose bacterial meningitis in Russia. In: Zollinger WD, Frasch CE, Deal CD, eds. Pathogenic Neisseria. 1996:515-6. 16 Gray LD. Fedorko DP. Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. Clin Microbioi Rev 1992; 5:130-45. 17 Brandtzaeg P. Pathogenesis of meningococcal infections. In: Cart-wright K. ed. Meningococcal disease. Chichester: Wiley & Sons, 1995:71-114. 18 Martin MA, Silverman HJ. Gram-negative sepsis and the adult respiratory distress syndrome. Clin Infect Dis 1992; 4:1213-28. 19 Boom R, Sol CJA. Salimans МММ et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbioi 1990: 28:495-503. 20 Osbome JM. Chacko GW, Brandt JT, Anderson CL. Ethnic variation in frequency of an allelic polymorphism of human FC7RIIA determined with allele-specific oligonucleotide probes. J Immunol Methods 1994; 173:207-17. 21 Cartwright К. Meningococcal carriage and disease. In: Cartwright K. ed. Meningococcal disease. Chichester: Wiley & Sons. 1995:115-46. 22 Noah N, Connolly M. Surveillance of bacterial meningitis in Europe . 1995. London: King's College School of Medicine & Dentistry, 1996. 23 Goldschneider I, Gotschlich EC, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus. I. The role of human antibodies. J Exp Med 1969: 129:1307-26. 24 Ferrante A. Beard LJ, Feldman RG. IgG subclass distribution of antibodies to bacterial and viral antigens. Pediatr Infect Dis J 1990: 9:S16-S24. 25 Fijen CAP, Bredius RGM, Kuijper EJ. Polymorphism of IgG Fc receptors in meningococcal disease: risk marker in complement deficient patients. Ann Intern Med 1993: 119:636. 26 Sanders LAM, Feldman RG. Voorhorst-Ogink MM et al. Human immunoglobulin G (IgG) Fc receptor 1IA (CD32) polymorphism and IgG2-mediated bacterial phagocyto.sis by neutrophils. Infect Immun 1995; 63:73-81. 27 Platonov AE, Vershinina IV, Dolgopolova AJ. Dankert J. Fijen CAP. Kayhty H. Bactericidal effect of human neutrophils on meningococci incubated in pre- and post-vaccination serum of complement deficient patients. In: Zollinger WD etal.. eds. Pathogenic Neisseria. 1996:178-9. 28 Jones SL, Brown EJ. Functional cooperation between Fc-y receptors and complement receptors in phagocytes. In: van de Winkel JGJ. Capel PJA. eds. Human IgG Fc receptors. Austin. Texas: RG Landes Co.. 1996:149-63. 29 Fijen K. Meningococcal disease and complement deficiency in the Netherlands. Thesis. Amsterdam: University of Amsterdam. 1995. 30 Drogari-Apiranthitou M. Fijen CAP, Dankert J, Kuijper EJ. Effect of vaccination on phagocytic killing of meningococci in individuals with late complement component deficiency. Exp Clin Immunogenet 1997: Correspondence: Dr A. E. Platonov, Central Institute of Epidemiology, Novogireesvkaya За, Moscow 111123, Russia. (C) 1998 Blackwell Science 2.Boom R. et al. // J.CIin.Microbiol, - 1990. - V.28, 495-503. 3.Corcish J.D. et al.// Vet Rec. - 199.1. -Jan. - V.12,42-43. 4.Fukushi H. Et al.// Int.J.Syst.Bact. -1992. - V.42. - N2. S.Gerbermann H.et al.//Der pract. Tier. -1991. - V.6, 521-528. 6.lnnis M.A. et al.// PCR protocols. -1990. - Academic Press, Inc., New York. 7.Kaltenboek B. Et al. //J. Clin. Microb. - 1992. - V.30. -N 5. S.Kaltenboeck B. Et al.//J. of Bact. - 1993. - V.175. - N2. 9.Pollard D.R.et al././Mol. andCel. probes. - 1989. - V. 3, 383-389. 10.Watson M.W. et al.// J.CIin Microb. - 1991. - V.29. - N6. 26 gene sequences of representatives of 4 chlamydial species were picked up from Genebank and their 1 kb parts were compares manually. Two Ch.psittaci and Ch.pecorum species-specific primers (in 3-end regions) and one common primer for these species (in 5-endl were chosen. Among 17 cnlan-wdial strains tested 13 gave PCR signal with primers specific for Ch.psittaci and 4 -- with primers specific for Ch.pecorum. Sensitivity of the developed PCR-system was 30 chlamydial genomes in a background of unrelated DNA corresponding 100000 eucariotic cells. Article 4.htm СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ. 1996. ?4 УДК 619:579.62:57.083.3 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД В ДИАГНОСТИКЕ ХЛАМИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (обзор) ИЛ. ОБУХОВ, Г.А. ШИПУЛИН, К.Н. ГРУЗДЕВ Проанализированы достоинства и недостатки современных лабораторных методов диагностики хламидиозов животных и птиц. Рассматривается принцип метода полимеразной цепной реакции, обсуждаются перспективы его использования в практической ветеринарии. Хламидиозная инфекция широко распространена среди практически всех видов млекопитающих и наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспышек. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (1-3). Особенностью хламидиозной инфекции, значительно усложняющей эпидемиологический надзор за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное ее течение (4). Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной профилактике, а также специфическому лечению хламидиозов животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов. В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала, а следовательно, необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной режимной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.) (1). Требование наличия живого возбудителя в анализируемой пробе значительно снижает чувствительность культурального метода на заведомо положительных образцах. Так, при выделении бактерий Chlamydia psittaci в культуре клеток из 144 проб, взятых от больных орнитозом птиц, положительные результаты были получены только в 45 случаях (31 %), причем специфичность метода составила 94,1 % (5). Низкая специфичность культурального метода наблюдается, как правило, если для учета результатов анализа используют исключительно микроскопию. В настоящее время культуральный метод все чаще применяют в общей схеме анализа только на первом этапе накопления специфических антигенов, которые затем выявляют методами иммуноферментного анализа или иммунофлуоресценции, что существенно повышает специфичность и практически не влияет на чувствительность диагностики. В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое значение приобрел подход, основанный на выявлении антигенов бактерий Ch. psittaci методом АГ-ИФА, имеющим по сравнению с культуральным следующие достоинства: возможность одновременного анализа большого числа образцов, быстрота (продолжительность анализа составляет 4 ч), безопасность для персонала. Поскольку с помощью этого метода выявляются как живые, так и неживые возбудители, то возможна работа с инактивированным материалом, в связи с чем существенно упрощаются требования к условиям транспортировки проб. Это расширяет возможности практического использования метода АГ-ИФА. Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низкая чувствительность и специфичность. Например, при анализе методом АГ-ИФА 144 заведомо положительных образцов фекалий и органов животных чувствительность и специфичность составили соответственно 51 и 93,3 % (5). Необходимо подчеркнуть, что в отличие от культурального метода низкие значения чувствительности и специфичности метода АГ-ИФА связаны в первую очередь с его принципиальными возможностями. Другой причиной низкой чувствительности обоих методов может служить непостоянное выделение возбудителя больными животными, а также латентное протекание инфекции. Проблема низкой специфичности рассмотренных выше подходов была решена с введением в схему анализа методов прямой и непрямой иммунофлуоресценции в качестве подтверждающего теста. Метод прямой иммунофлуоресценции предусматривает использование меченных флуо-ресцеин-изотиоционатом (ФИТЦ) моноклональных антител как к липо-полисахаридному комплексу, так и к основному белку наружной мембраны (МОМР) хламидий. Для этого фиксированный на предметном стекле мазок обрабатывают флуоресцирующими антителами и после непродолжительной инкубации исследуют под флуоресцентным микроскопом. При непрямой иммунофлуоресценции проводят непрямое окрашивание антигенов в мазке. Вначале мазок инкубируют с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей антитела к хламидиям, а затем образовавшиеся комплексы антиген-антитело окрашивают антивидовыми меченными ФИТЦ антителами к глобулинам сыворотки, используемой на первом этапе анализа. Методы иммунофлуоресценции не требуют много времени для проведения, а также наличия живого возбудителя в пробе; позволяют выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях. Кроме того, они обнаруживают высокую по сравнению с культуральным методом специфичность (до 99 %) (6).Однако следует отметить, что последняя может быть достигнута только за счет относительно более низкой чувствительности, так как вывод об отрицательном результате анализа делается лаборантом на основании отсутствия хламидий при просмотре достаточного количества эпителиальных клеток. Учитывая, что для достоверного выявления хламидий необходимо обнаружить определенное число элементарных телец во всем исследуемом образце, чувствительность анализа зависит также от опыта работы лаборанта (6). В последнее время для доказательства хламидиозов животных все чаще используют методы косвенной диагностики, среди которых основное место занимает иммуноферментное обнаружение в сыворотке крови больных животных специфических антител (метод АТ-ИФА). Реакция связывания комплемента (РСК), ранее используемая для этих целей, как было однократно показано, не обладает достаточной чувствительностью (1). При сопоставлении ИФА-метода выявления антител и прямых методов детекции хламидий, как правило, наблюдается высокий процент дискордантных результатов. Так, при анализе методом АГ-ИФА проб, полученных от 426 сероположительных попугаев, было обнаружено лишь 5,2 % выделителей возбудителя (7). Согласно другим данным, у 30 % сероположительных попугаев, импортированных в ФРГ, удалось выделить бактерии вида Ch. psittaci в культуре клеток, хотя только одной птице был поставлен диагноз "острый пситакоз". В то же время эпидемиологическое обследование в группах внешне здоровых дневных хищных птиц показало высокую долю носительства специфических к хламидиям антител (75-78,6 %) (5). Следовательно, положительные результаты, полученные методом АТ-ИФА, не являются доказательством активного инфекционного процесса и требуют обязательного подтверждения каким-либо прямым методом. Кроме того, эффективность карантинных мероприятий при возникновении угрозы рассеивания инфекции носителями прямо зависит от выбора такого метода диагностики, который позволил бы не только выявить асимптоматичных носителей, но и проследить за их лечением. В подобных ситуациях в связи с тем, что антитела к хламидиям имеют тенденцию достаточно долго сохраняться в крови животных после перенесенной инфекции, предпочтение должно отдаваться методам прямого обнаружения возбудителя. В настоящее время одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 1983 году Mullis (Cetus Corporation, США) открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, за что был удостоен Нобелевской премии. В 1984 году исследователи этой корпорации разработали метод ПЦР, позволяющий всего за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК. В настоящее время этот метод практически вытеснил длительную и трудоемкую процедуру ДНК-гибридизации (8). Метод ПЦР позволил достигнуть больших успехов в области генетического картирования, изучения генетического полиморфизма, мутаций и генетических механизмов молекулярной иммунологии, а также в молекулярной вирусологии, онкологии, судебной медицине, диагностике наследственных и инфекционных заболеваний. Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для инициации полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была статистически уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов, каждый из которых начинается со стадии денатурации молекулы ДНК (рис.). Схема ПЦР-анализа клинического материала от инфицированного хламидиями животного: 1 - подготовка проб к проведению ПЦР (очистка ДНК от ингибиторов ДНК-полимеразы и концентрирова-ние); 2 - плавление ДНК (первая стадия ПЦР-амплификации); 3 - отжиг праймеров (вторая стадия ПЦР-амшшфикации); 4 - достройка комплементарных цепей ДНК (третья стадия ПЦР-амплификации); 5 - продукт ПЦР (ампликон); б и 7 - соответственно злектро-роретическая и гибридизаци-)нно-ферментная детекция гродуктов ПЦР. На первой стадии при нагревании реакционной смеси до 96 "С разрываются водородные связи, соединяющие спиральные цепи. На второй стадии температуру реакционной смеси понижают до заранее определенных значений, соответствующих температуре отжига праймеров, что приводит к комплементарному их взаимодействию с последовательностями, окаймляющими фрагмент-мишень. Третьей стадией является элонгация праймеров в сторону фрагмента-мишени под действием ДНК-полимеразы. Продолжительность реакции обычно составляет 30-40 циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к экспоненциальному нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза или гибридизации с меченым ДНК-зондом. Возможность быстрого и практически полного обнаружения многих возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных в образцах крови, мочи, слюны, в различных тканях организма методом амплификации генов при помощи ПЦР была продемонстрирована уже через несколько лет после ее открытия. Было показано, что ПЦР обладает высокой чувствительностью и в то же время не требует, подобно серологическим методам, наличия иммунного ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями инфекции и выявлять ее латентное течение. Позже стали разрабатывать варианты ПЦР, позволяющие не только выявлять патогенные микроорганизмы, но и определять их концентрацию в биологическихсредах, активность в организме хозяина, а также различать патогенные формы одного и того же типа возбудителя. Для диагностики хламидиозов человека и животных ПЦР была впервые применена в 1989 году (9). На модельных системах культур клеток, инфицированных бактериями Ch. trachomatis или Ch. psittaci с известным титром, авторам удалось методом ПЦР дифференцировать эти виды рода Chlamydia и детектировать ДНК хламидий с чувствительностью 1 бактерия на 100 тыс. инфицированных эукариотических клеток. Кроме того, была показана высокая специфичность метода ПЦР: ни один из 13 представителей других родов бактерий не давал положительного ответа. Авторы разработали систему из четырех праймеров, ограничивающих два фрагмента длиной 240 и 119 нуклеотидов рибосомального гена (16S). Первая пара праймеров позволяла детектировать оба вида хламидий. Вторая пара праймеров обладала специфичностью только к бактериям Ch. psittaci. К сожалению, в этой работе был протестирован всего лишь один штамм Ch. psittaci, в связи с чем авторы не смогли сделать вывод о возможности детекции других представителей этого вида предлагаемыми праймерами. В 1991 году Rasmussen с соавт. предложили оригинальные прайме-ры и изучили их специфичность в ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из 24 коллекционных штаммов Ch. psittaci (10). Подобранные праймеры соответствовали консервативным участкам гена главного поверхностного белка (МОМР) хламидий и ограничивали фрагмент длиной около 1000 нуклеотидов. Кроме того, был предложен зонд, комплементарный внутреннему участку амплифицируемого фрагмента. Полный ПЦР-анализ состоял из трех этапов: выделение ДНК, ПЦР и выявление продуктов ПЦР методом дот-гибридизации с радиоактивно меченным зондом. В сравнительных опытах установлено, что гибридизационный метод выявления хламидий на фильтрах не позволяет обнаружить менее 100 тыс. элементарных телец, в то время как чувствительность ПЦР составляет 10 хламидий в пробе, причем 22 из 24 исследованных образцов штаммов Ch. psittaci дали положительный ответ в ПЦР. Поскольку штаммы бактерий с отрицательным в ПЦР ответом были исходно выделены из конъюкти-вальной жидкости коалы, можно думать о значительном отличии ген.-МОМР этих штаммов от всех остальных. Несмотря на то, что исследования были выполнены на упрощенных модельных системах, авторы сделали важный вывод о том, что чувствительность ПЦР определяется всеми тремя этапами ПЦР-анализа, при этом большое значение имеет подготовка проб. Следовательно, уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий. Позже высокие возможности ПЦР были подтверждены на клиническом материале. Например, Holland с соавт. использовали ПЦР для обнаружения и дифференцирования трех видов бактерий рода Chlamydia: Ch. trachomatis, Ch. psittaci, Ch. pneumoniae (11). С этой целью авторы разработали оригинальную систему ПЦР-детекции хламидий, состоящую из трех праймеров, комплементарных областям гена МОМР хламидий и рестриктазы EcoRI. Обнаружено, что вид Ch. trachomatis диагностируется всеми тремя праймерами, а три продукта ПЦР имеют сайг рестрикции EcoRI. Фрагмент гена МОМР бактерий Ch. psittaci амплифицировался только двумя праймерами и не расщеплялся этой рестрикгазой. Бактерии С/г. pneumoniae детектировались также одной парой праймеров, но специфичный фрагмент имел сайг рестрикции EcoRI. При этом была продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность разработанного варианта ПЦР в модельных условиях. Кроме того, методом ПЦР протестировано несколько клинических образцов, дающих положительный ответ в культуре клеток, и получено 100 % подтверждение результатов. Аналогичный, но более простой вариант ПЦР предложили Rasmussen с соавт. (12). В области гена МОМР ими была найдена пара праймеров, консервативная для всех трех видов хламидий, но амплифи-цирующая вариабельный фрагмент ДНК. Поэтому после ПЦР проводили рестрикцию ферментами EcoRI и HindIII или Pstl. Этот вариант ПЦР успешно использовали для детектирования и дифференцировки двух штаммов Ch. pneumoniae, 11 штаммов Ch. psittaci и 10 сероваров С/г. trachomatis. С помощью этого метода были протестированы 15 клинических образцов, в 8 из которых культуральным методом выявлены бактерии С/г. trachomatis. ДНК хламидий обнаруживалась методом ПЦР в пяти образцах в том случае, если выявление ампликонов проводили электро-форетическим методом. В то же время наличие ДНК хламидий удалось доказать во всех 8 пробах после ПЦР с последующей радиоактивной гиб-ридизационной детекцией продуктов ПЦР. В 1991 году появилось сообщение Corcish с соавт. о первом применении метода ПЦР для диагностики пситакоза птиц в практической ветеринарно-диагностической лаборатории (13). Авторы предприняли беспрецедентные (и до настоящего времени) сравнительные исследования по тестированию проб экскрементов птиц методами ПЦР и имму-ноферментного выявления антигена. Вариант ПЦР, использованный в этой работе, был разработан Hewinson с соавт. (14) и представлял собой модификацию метода Rasmussen (10). В общей сложности двумя методами было исследовано более 1000 проб. Обнаружено, что детекция антигенов бактерий Ch. psittaci методом ИФА может давать до 75 % ложнопо-ложительных результатов. В то же время ПЦР, дополненная гибридиза-ционной детекцией ампликонов, выявляла в клиническом материале ДНК хламидий с показателями чувствительности и специфичности, близкими к 100 %. В отличие от анализа культуральным методом, занимавшего до 3 нед, результаты ПЦР обычно получали в течение 48 ч. На основании полученных данных авторы разработали рекомендации для проведения ПЦР-диагностики пситакозов птицы. По их мнению, используемые в настоящее время методы прямого обнаружения хламидий не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Однако метод ПЦР позволяет достоверно судить об инфицированности птицы. В связи с тем, что возбудитель выделяется у больного животного непостоянно, необходимо исследовать не менее трех образцов экскрементов от одной и той же особи, взятых в течение 4-5 сут. При скрининговом обследовании птиц с помощью ИФА метод ПЦР должен быть использован в качестве подтверждающего теста. В случае обнаружения контактов заболевших пситакозом птиц или человека со здоровыми людьми или птицами метод ПЦР является методом выбора для лабораторной диагностики орнитоза у контакторов (13). Значение этой работы для практической диагностики хламидиозов птиц трудно переоценить. Однако предлагаемая авторами методика пригодна для решения только одной прикладной задачи - диагностики хла-мидиозов, вызванных бактериями вида Ch. psittaci. В настоящее время известно, что хламидиозы животных и птиц могут вызываться как минимум тремя из четырех выделенных видов хламидий: Ch. psittaci, Ch. trachomatis и недавно открытым Ch. ресогит (15). Кроме того, метод Corcish с соавт. требует использования радиоактивных изотопов, что делает его затратным, длительным и опасным для персонала и тем самым затрудняет его внедрение в лабораториях ветеринарной службы. Следующий большой вклад в разработку и внедрение метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных и птиц внесли работы Kaltenboeck с соавт., в которых не только решен ряд основных задач практической ПЦР-детекции хламидий, но и доказаны неограниченные возможности использования ПЦР в молекулярной эпидемиологии хламидиозов (16-19). Для этих целей авторы сначала идентифицировали у 24 штаммов хламидий часть нуклеотидных последовательностей, составляющих 81 % целого гена МОМР. Коллекция штаммов включала представителей всех известных сегодня видов хламидий. Полученные последовательности были выравнены друг относительно друга и разбиты на четыре неперекрывающихся кластера, каждый из которых соответствовал одному из четырех видов хламидий. Затем были определены участки, строго консервативные для всех изолятов, и в этих консервативных областях, располагающихся по краям гена МОМР, выбрана система из четырех вложенных родоспецифичных праймеров таким образом, что внешние праймеры ограничивали фрагмент гена МОМР длиной 1120 нуклеотидов, а внутренние - фрагмент длиной 950 нуклеотидов. Продукты ПЦР, полученные с внешними праймерами, подвергали реамплифи-кации с внутренними, а фрагмент длиной 950 нуклеотидов выявляли методом электрофореза. Чувствительность этого нерадиоактивного варианта ПЦР позволяла детектировать не менее трех бактерий в пробе в присутствии фоновой нагрузки ДНК человека, эквивалентной 100 тыс. клеток. Авторам удалось подобрать систему видоспецифичных праймеров, каждый из которых с общим родоспецифичным праймером мог образовать фрагмент, длина которого была характерна только для одного вид-хламидий. Кроме того, они разработали систему более детального типи-' рования хламидий рестрикционным анализом видоспецифичных ПЦР-фрагментов. Для этого были подобраны рестриктазы, позволяющие не только оценивать результаты определения вида, получаемые при использовании видоспецифичных праймеров, но и проводить внутривидовую дифференциацию хламидий. Разработанная система была апробирована на клинических образцах молока, полученных от коров (п == 7) с маститом неясной этиологии. У двух из них были детектированы методом ПЦР бактерии вида Ch. psittaci. Рестрикционный анализ специфических ПЦР-фрагментов позволил определить вид и тип хламидий (птичий тип 2Ь). Эта работа, несмотря на небольшое число протестированных клинических проб, по-видимому, займет особое место в истории разработки метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных. Впервые удалось на основе последовательностей одного гена-мишени создать универсальные родоспецифические праймеры, позволяющие с высокой чувствительностью диагностировать хламидиоз и сразу же давать видовую и типовую характеристику возбудителя. Ценность данных молекулярного типирования возрастает еще больше, если принять во внимание тот факт, что продукт гена, использованного авторами для типирования, может быть использован при разработке вакцин против хламидий. Следовательно, в этих экспериментах были показаны не только диагностические возможности метода ПЦР, но и одновременно на основе данных молекулярных исследований классифицирован возбудитель, что до сих пор представлялось невозможным. Таким образом, возможность применения ПЦР-диагностики хламид иозов животных в настоящее время продолжает изучаться. Рассмотренные нами данные литературы демонстрируют перспективы, которые открывают разработка и использование этого метода в диагностических ветеринарных лабораториях. Прежде всего, это быстрый и надежный диагноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика хламидиозов. Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий. ЛИТЕРАТУРА 1. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. Киев, 1991. 2. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. М., 1994. 3. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. М., 1979. 4. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней /Под ред. В.И. Покровского. М., 1993, 1: 357-366. 5. Gerbermann H., J a k о b у J.R., Kosters J. Chlamidienbefimde aus einer groberen Geifrogelhaltung. J. Vet. Med., 1990, 37: 739-738. 6. Вяянанен П. Диагностика хламцдийных инфекций. В сб.: Диагностика и лечение хламидийных инфекций. М., 1987. 7. Gerbermann H.,Janeczek F. Chlamydiose bei Vogein: gegenwartige Situation und altemativen der Diagnose und Belcampfung. Pract. Tieiarzt, 1991, 6: 521-528. 8. S a i k i R.K., Sharf S.,Faloona F. e.a. Enzymatic amplification ofb-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Sci., 1985, 230: 1350-1354. 9. Pollard D.R., Т у 1 е г S.D., N g С. W. e.a. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp. Mol. Cel. Probes, 1989, 3: 383-389. 10.Rasmussen S.J., Т i m m s P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett., 1992, 77: 169-174. 11. H о 11 a n d S.M., G а у d e s C.A., Q u i n n T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect. Dis., 1990, 162: 984-987. 12-Rasmussen S.J., Douglas P.P., Т i m m s P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes, 1992, 6: 389-394. 13. С о г с i s h J.D., В e v a n B.J. Diagnosis of psittacosis. Vet. Rec., 1991, 12: 42-43. 14. H e w i n s о n R.G., Griffiths P.C., R a n k i n S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. Vet. Tec., 1991, 128: 381-382. 15. F u k u s h i H., H i г a i K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. Int. J. Syst. Bact., 1992, 42: 306-308. 16.Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., S t о r z J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 1969-1975. 17-Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., S t о r z J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp. J. Clin. Microbiol., 1992, 30: 1098-1104. 18.Kaltenboeck B.,Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamidiae isolated from swine. Am. J. Vet. Res., 1992, 9: 1482-1487. 19-Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., S t о r z J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the chlamidial species. J. Bact.,1993, 175: 478-502 Article 5.htm Heterozygous C8/3 complement deficiency does not predispose to meningococcal disease A. E. PLATONOV, G. A. SHIPULIN, 0. JU. SHIPULINA, I. V. VERSHININA & P. DENSEN* Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia, and *Department of Internal Medicine, The University of Iowa, Iowa City, 1A, USA SUMMARY We have identified 42 Russian patients with homozygous C8b complement component deficiency, all of whom had experienced at least one episode of systemic meningococcal disease. About 90% of these individuals have a C->'T exchange in exon 9, leading to a premature stop codon. If, like the homozygous-deficient state, heterozygous C8¦3 deficiency constitutes a risk factor for meningococcal disease, it would be expected to be detected with increased frequency among individuals suffering from this disease. Using allele-specific polymerase chain reaction (PCR), we studied 153 consecutive patients with meningococcal disease admitted to the Moscow Hospital for Infectious Diseases to determine the frequency of C8 null allele. No individuals with heterozygous С -> Т exchange were identified among these 153 patients, despite the fact that seven persons were detected who had homozygous C8b deficiency, caused by the same C->T exchange in exon 9, and one patient who had C7 component deficiency. Thus, heterozygous deficiency, although more frequent than homozygous deficiency in the general population, does not result in a substantial increase in susceptibility to meningococcal disease. INTRODUCTION The risk of systemic meningococcal disease (MD) is approximately a thousand times greater in individuals with inherited late complement component deficiency (LCCD) than in complement-sufficient persons [1-3]. In Moscow, where the incidence ofMD is bout three cases/100000 population per year, 3% of infected patients were found to have LCCD [3]. The median number of episodes of MD per individual with LCCD was two, and 90% of affected family members, exclusive of the proband, experienced at least one episode of MD. Less is known about the contribution of heterozygous LCCD to susceptibility to MD. Although about 300 patients with homozygous LCCD have been identified worldwide, there has been no systematic evaluation of episodes of MD in their presumably heterozygous parents and offspring. Forty-nine Russian LCCD patients reported no cases of MD in more than 160 presumed heterozygous relatives [3,4]. Based on these data, the heterozygous LCCD state does not appear to be closely associated with MD. However, an association cannot be excluded a priori, since a frequency of even one case/1000 heterozygotes would still represent a 30-fold increase in rate. Accurate identification of individuals with heterozygous LCCD at the phenotypic level among patients with MD has been difficult because the functional assays used to measure these proteins display a wide range of normal activity in the general population. In addition, assays for the immunochemical quantification of these proteins are not readily available and are subject to some of the same limitations as the functional methods. The advent of molecular probes for C8b null alleles, combined with our demonstration that in Russia 90% (44/49) homozygous LCCD patients with MD lack C8/3 [3], and that a single molecular defect accounts for 89% of null alleles in C8)3 deficiency [4], has provided an opportunity to assess the frequency of heterozygous C8 deficiency among individuals with MD and its possible influence in increasing the risk of these individuals to MD. PATIENTS AND METHODS One hundred and fifty-three patients with MD admitted sequentially to the Moscow Hospital for Infectious Disease in 1994-95 were the focus of this study. The age and sex distribution corresponded to that observed for patients admitted previously with MD in Moscow, namely 79 patients (52%) were younger than 5 years and 88 (58%) were males. With informed consent, 3-0 ml of venous blood were obtained and DNA was extracted using standard methods [4,5]. An additional 3-0 ml of blood were used to prepare serum samples stored at -70°C. The haemolytic activity of the classical and alternative complement pathways, as well as the haemolytic activity of complement components, was measured in patient sera by standard methods, as described elsewhere [3].Allele-specific amplification was performed as described elsewhere [4,5], with minor modifications. Amplitaq polymerase (Perkin-Elmer) (1*25U), 250 mM dNTPs, 10 рм of each primer (3' -C, 3' -A, Ex9u, and Ex9d, listed in [5]) in buffer (10 mM Tris pH 8-0, 50 mм КСl, 1*5 тм MgCl2) in a total reaction volume of 50 ml were used in the reaction. Thirty cycles were performed in a thermocycler (Perkin-Elmer Cetus 480; Norwalk, CT) using a 'touchdown' protocol; denaturation, 94°C 30s; annealing 65-> 60°C 1 min, with two cycles at each step-down temperature until 60°C was reached, at which point 20 cycles were performed; and elongation, 72°C 1 min. Appropriate controls, namely the DNA from previously identified patients having either homozygous or heterozygous С-> Т exchange in exon 9, were included along with patient DNA in each polymerase chain reaction (PCR) run. Normal amplicon, amplified by 3'-C and Ex9u, and mutated amplicon, amplified by 3'-A and Ex9d, differed in length and were differentiated by electrophoresis in agarose gel. RESULTS AND DISCUSSION No individuals with heterozygous C->T exchange at position 1309 were found among the 153 patients with MD, although this mutation was consistently identified in the positive controls (previously identified patients having either homozygous or heterozygous C->T exchange in exon 9). On the other hand, seven patients with homozygous C8b deficiency and one patient with C7 component deficiency were identified among the same 153 persons with MD. Homozygous C8b -deficient patients had the same null allele, namely С -> Т exchange in exon 9. These patients are indicated as nos 33, 34, 36, 37, 39, 41, 42 in Table I of [4]. All homozygous-deficient patients had no haemolytically active C8b or, correspondingly, C7 component in their serum samples. Other patients had typical patterns of complement activity that was either decreased in acute stage of severe meningococcaemia or nearly normal in other conditions. Access to a large population of individuals with MD would allow detection of a sufficient number of heterozygous C8¦8-deficient individuals to provide a reasonable estimate of the true frequency of this condition among individuals with MD. However, in our study we did not detect any heterozygous-deficient individuals among 153 persons with MD. Nevertheless, since the detection of the heterozygous state in each patient compared with any other patient is an independent event, the binomial distribution can be used to calculate the probability of this observed result (0/153) for a range of assumed true frequencies [6]. Using this approach our data indicate, at a level of P < 0*05, that the true frequency of heterozygous C8b deficiency among individuals with MD is <0*02. This conclusion provides an opportunity to estimate the susceptibility of heterozygous C8b-deficient individuals to MD relative to complement-sufficient persons by comparing the frequency (P) of the heterozygous C8b-deficient state among individuals with MD with the frequency (Q) of the heterozygous state in the general population. If these frequencies are the same, i.e. P = Q, then the relative susceptibility is 1. If these frequencies differ then they are related to each other in proportion (k) to their susceptibility factor and P = kQ, or k = QIP. Thus k. the relative susceptibility of heterozygotes to MD, can be estimated using a value of P = 0*02 (the upper limit of P, calculated in the previous paragraph) and Q = 0*02, as calculated from the Hardy-Weinberg equation for genetic equilibrium and employing the reported frequency (R) of homozygous C8b deficiency in the Muscovite population of 0*0001 [3], which is in agreement with independent observations in other countries [2,7]. In this case k = 1 and heterozygous-deficient persons do not differ from normals in their susceptibility to MD. However, since R is itself an estimate. it is instructive to examine the effect of a range of values for Q and R (the prevalence of the heterozygous and homozygous C8b deficiency states in the general population, respectively) on k- the relative susceptibility of heterozygotes to MD. This relationship is shown in Fig. 1. Obviously the absolute values of k, Q and R (Fig. 1) are correct, only as far as the initial assumptions and estimations of this analysis are valid. Formally, as k = PIQ < 0*02/Q, any value of k below the curve is possible. However, as can be seen from Fig. 1, values for Q and R above 0*02 and 100x10-6 determine a value for k < 1*0. Since this would mean that heterozygotes were less susceptible to MD (i.e. protected) than normals, it is highly unlikely that these values arf relevant to the true estimate of k. At the opposite extreme, value? for Q and R less than 0*01 and 25xlO-6 are also unlikely, because our studies examining only a small fraction of the Muscovite population have already detected a number of homozygous-deficient persons close to this estimate. Thus, these data indicate that the susceptibility of heterozygous-deficient persons to MD is likely to be the same as or not more than twice that observed in the normal population. These conclusions could not readily be reached by observing the heterozygous relatives of homozygous-deficient individuals. Consider, for example, 100 heterozygous-deficient relatives, each of whom was observed for 50 years and in whom no cases of MD were reported during 5000 observational years. Fig 1. Estimate of relative susceptibility of heterozygous C8 complement component-deficient individuals to meningococcal disease as a function of the prevalence of heterozygous and homozygous deficiency in the general population. Abscissa, Prevalence of heterozygous (Q) and homozygous (R) C8b deficiency in the general population; ordinate, relative susceptibility of helerozygous-deficient individuals to meningococcal disease. As discussed in the text. pairs of values for R and Q that yield a value for k < I are unlikely, since in this case heterozygotes would be less susceptible to meningococcal disease than normal individuals. Alternatively, pairs of values for R and Q < 0*000 025 and 0*01. respectively, are unlikely because the observed prevalence approaches these values. Thus. the hatched area between the indicated values lor R and Q defines the likely values for k and suggests that the relative risk of meningococcal disease in CSb hetcrozvgotes is between I and 2 times that in normal individuals. In this situation analysis using the binomial distribution would confirm only what the incidence of MD in such relatives is, < 0*0006 cases/individual per year (compared with the observed 0*00004 cases/individual per year in complement-sufficient hosts in Russia), and that k is < 15. Using this approach in order to confirm that k < 2 would necessitate more than 35 000 observational years and require identification of more than 700 heterozygous C8-deticient relatives tor observation for their entire life. CONCLUDING REMARKS In general, the level of total complement activity and C8 concentration in the serum of individuals with heterozygous C8 deficiency is >20% of that in normal persons [1.2]. In vitro, 20% normal human serum has sufficient bactericidal activity and supports the bactericidal activity of human neutrophils against meningococci [8-11]. These coupled observations are consistent with the above calculations, and together provide experimental support for the conclusion that heterozygous-deficient individuals are not t increased- risk for MD, or only minimally so. Moreover, they suggest that episodes of systemic MD in complement-sufficient hosts are unlikely to be due solely to a temporal decrease in their complement levels caused by concurrent disease or other reasons. ACKNOWLEDGMENTS We are grateful to Valentina Ivanova. Galina Kovtun. Ludmila Kulagina, llya Kulagin. and Vladimir Platonov for helpful technical assistance. The research described in this study was made possible in part by Grant N44000/N44300 to A.E.P. from the International Science Foundation and Grant 1010-СТ93-0011 to A.E.P. from the INTAS (International Association for the Promotion of Co-operation with Scientists from the Independent States of the Former Soviet Union), and by a merit review to P.D. from the Department of Veterans Affairs. REFERENCES 1 Ros.s SC. Dcnsen P. Complement deficiency states and infection: epidemiology, pathogenesis and consequences of neisserial and other infections in an immune deliciency. Medicine (Baltimore) 1984: 63:243-73. 2 Figueroa JE. Densen P. Infectious diseases associated with complement deficiencies. Clin Microbiol Rev 1991: 4:359-95. 3 Platonov AE, Beioborodov VB. Vershinina IV. Meningococcal disease in patients with late complement component deficiency: studies in the USSR. Medicine (Baltimore) 1993; 72:374-92. 4 Saucedo L. Ackermann L, Platonov AB. Gewurz A, Rakita R. Densen P. Delineation of additional genetic bases tor C80 deficiency: prevalence of null alleles and predominance of С-T exchange in their genesis. J Immunol 1995; 155:5022-8. 5 Kaufmann TG, Hansch G, Rittner C. Spath P, Tedesco F. Schneider PM. Genetic basis of human complement C8f3 deficiency. J Immunol 1993: 150:4943-7. 6 Altman DG. Practical statistics for medical research. London: Chapman and Hall, 1991. 7 Inai S. Akagaki Y. Moriyama T. Fukumori Y. Yoshimura K.. Ohnoki S. Yamaguchi H. Inherited denciencies of the late-acting complement components other than C9 found among healthy blood donors. Int Arch Allergy AppI Immunol 1989: 90:274-9. 8 Taylor PW. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against Gram-negative bacteria. Microbiol Rev 1983: 47:46-83. 9 Schlesinger M. Greenberg R. Levy J. Kayhty H. Levy R. Killing of meningococci by neutrophils: effect of vaccination on patients with complement deficiency. J Infect Dis 1994; 170:449-53. 10 Andreoni J. Kayhty H, Densen P. Vaccination and the role of capsular polysaccharide antibody in prevention of recurrent meningococcal disease in late complement component-deficient individuals. J Infect Dis 1993: 168:227-31. 11 Platonov AE. Vershinina IV. Dolgopolova AJ. Dankert J. Fijen CAP. Kayhty H. Bactericidal effect of human neutrophils on meningococci incubated in pre- and post-vaccination serum of complement deficient patients, [n: Zollinger WD. Frasch CE. Deal CD. eds. Pathogenic neisseria. Abstracts of the Tenth International Pathogenic Neisseria Conference. Baltimore. 1996:178-9. Correspondence: Dr Alexander E. Platonov, Laboratory of Meningococcal Infection, Central Institute of Epidemiology, Novogireevskaya St. ЗА. Moscow 11 ] 123. Russia. Accepted for publication 27 January 1997 (c) 1997 Blackwcll Science Ltd. Clinical and Eperimental Immunology, 108:497-499 Article 6.htm ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, N5, 1998 (C) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК616.98:578.828.6]-06:617.7-022.6]-07 Н. Р. Марченко, В. И. Шахгилъдян, О. Ю. Шипулина, А. В. Кравченко ВИРУСНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНА ЗРЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ НИИ глазных болезней РАМН; Российский научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом, Москва Значительный рост заболеваемости ВИЧ-инфекцией, а также достигнутые в настоящее время определенные успехи в комбинированной химиотерапии этой инфекции, продлевающие жизнь таких пациентов, привели к тому, что офтальмологическая патология среди ВИЧ-инфицированных становится все более распространенной [1-3, 11]. Ведущую роль в развитии инфекционных поражений глаза при ВИЧ-инфекции играют вирусы группы герпеса - вирусы простого [8] и опоясывающего герпеса [4, 7, 9] и особенно цитомегаловирус (ЦМВ) [5, 6, 10, 12]. Некоторые из этих осложнений, такие как цитомегаловирусный ретинит (ЦМВР) [12], острый ретинальный некроз [9, 11], могут приводить к слепоте или слабовидению, причем иногда это становится первым проявлением ВИЧ-инфекции. Частой находкой при ВИЧ-инфекции является микроангиопатия сетчатки - ватообразные очаги, ретинальные геморрагии, реже - микроаневризмы. Они длительное время считались неспецифическим симптомом ишемии внутренних слоев сетчатки (подобные изменения часто обнаруживаются при сахарном диабете и гипертонической болезни), однако в последнее время из пораженных тканей был выделен геном ЦМВ [б]. Клиническое значение этого синдрома остается неясным - все исследователи сообщают об отсутствии нарушения зрительных функций при этих состояниях, а также о доброкачественном течении, хотя изменения в подавляющем большинстве случаев обнаруживались у пациентов с далеко зашедшими нарушениями иммунитета - низким уровнем СВ4-клеток (менее 100 в 1 мм3), что клинически обычно сопровождалось развитием многочисленных вторичных инфекционных осложнений. Следует отметить, что патогенез ЦМВ-инфекции других органов (желудочно-кишечного тракта, легких, нервной системы) в значительной степени обусловлен микроциркуляторными нарушениями. Поэтому значительный интерес представляет связь ВИЧ-микроангиопатии с клиническими и лабораторными проявлениями ЦМВ-инфекции. Мы предприняли попытку дать анализ структуры офтальмологической патологии при ВИЧ-инфекции и разработать методы лечения и профилактики поражений глаза при СПИДе. Материалы и методы Исследования выполнены в 1993-1996 гг. на базе Российского центра профилактики и борьбы со СПИДом совместно с НИИ глазных болезней РАМН. Под наблюдением находилось 370 ВИЧ- инфицированных пациентов (310 мужчин и 60 женщин) в возрасте от 5 лет до 61 года, большинство (7196) составляли лица в возрасте 20-45 лет. Офтальмологическое обследование включало определение остроты зрения по обычной методике, биомикроскопию, непрямую офтальмоскопию, В клинических исследованиях применяли общепринятые методики. Помимо этого, всем пациентам проводили исследование иммунного статуса (дифференцированный подсчет субпопуляций лимфоцитов, определение абсолютного и относительного количества С04-клеток.) Для обнаружения возможных источников патологических изменений глаза выполнен комплекс лабораторных исследований - определение иммуноглобулинов класса М и G к ЦМВ. Проводили также обнаружение генома ЦМВ методом цепной полимеразной реакции (ПЦР). При данном исследовании определялся десятичный логарифм количества копий вирусного генома в 100 000 лейкоцитах периферической крови (так оценка 4+ соответствовала 10 000 молекул ДНК ЦМВ и т. д.). Результаты и обсуждение Как видно из табл. 1, наиболее распространенной офтальмоскопической находкой у ВИЧ-инфицированных пациентов явилась ВИЧ- микроангиопатия. В большинстве случаев отмечены ватообразные очаги - типичные фокусы белого цвета во внутренних слоях сетчатки, проминирующие в стекловидное тело. Иногда они сопровождались геморрагическими проявлениями. Таблица 1 Изменения глаз, обнаруженные у 370 ВИЧ-инфицированных пациентов Изменения Число больных (глаз) абс. % В И Ч-микроангиопатия: 30(46) 8,1 ватообразные очаги ретинальные геморрагии 4 (6) 1,1 микроаневризмы 2(3) 0,5 ЦМВР 15 (26) 4,1 Острый ретинальный некроз 1 (2) 0,27 Древовидный герпетический кератит 2 (2) 0,54 Герпетический иридоциклит 1 (1) 0,27 Аденовирусный кератоконъюнктивит 1 (1) 0,27 Саркома Капоши иск и конъюнктивы 2 (2) 0,54 Всего... 58(89) 15,7 Чаще встречались небольшие геморрагии по периферии очага, локализующиеся между слоем нервных волокон и внутренней пограничной мембраной. Мелкие точечные и полосчатые геморрагии обычно обнаруживались в зонах с внешне не измененной сетчаткой, преимущественно в параэкваториальных отделах. К числу редко обнаруживаемых изменений можно отнести ретинальные микроаневризмы, выявленные у 2 пациентов. Описанные изменения не имели по виду отличий от проявляющихся при непролиферативных формах диабетической ретинопатии. но геморрагии и микроаневризмы были не столь многочисленными. Следует отметить, что среди обследованных пациентов не было ни одного с системной патологией (помимо ВИЧ), наличием которой могла бы быть обусловлена ретинальная микроангиопатия. После исчезновения ватообразных очагов в этой зоне не было признаков хориоретинальной атрофии и пролиферации пигментного эпителия, зрительные функции также не страдали. Микроваскулярные изменения в подавляющем большинстве случаев обнаруживались у пациентов с далеко зашедшими нарушениями иммунитета - низким уровнем С04-кдеток (у 74% больных менее 100 в 1 мм3), что клинически обычно сопровождалось развитием многочисленных вторичных инфекционных осложнений. Значительный интерес поэтому представляло определение прогноза при обнаружении ватообразных очагов, а также связи между ВИЧ-микроангиопатией и другими патологическими изменениями глаза, в первую очередь ЦМВР (табл. 2). Следовательно, ВИЧ-ангиопатия значительно чаще встречается у пациентов с активацией ЦМВ, подтвержденной обнаружением IgM и высоким сигналом ПЦР (более 4+). Это согласуется с данными зарубежных исследователей, нашедших ДНК ЦМВ в зонах изменений (во внешне не измененной сетчатке ДНК не обнаружена) [б]. Учитывая это, можно считать ватообразные очаги предвестником манифестации ЦМВ-инфекции (это может быть ретинит или серьезные экстраокулярные формы этой инфекции) и проводить превентивную химиотерапию, не дожидаясь развития этих осложнений. Таблица 2 Зависимость офтальмоскопических изменений от уровня ДНК ЦМВ в клетках крови Группа ДНК ЦМВ Число Больных Ватообразные очаги ЦМРВ Первоначально Через 1,5 мес Первоначально Через 1,5 мес 1-я 0-1+ 57 2 (3,5) 2 (3,5) 0 0 2-я 2-3+ 62 5 (8,1) 6 (9,7) 0 0 3-я 4+ и выше 33 6 (18,2)* 16 (48,5)** 11 (33,3)** 11 (39,4)** Примечание. Одна звездочка - различие между 1-й и 3-й. 2-й и 3-й группами недостоверно ( р > 0,01), лис - различие между 1-й и 3-й, 2-й и 3-й группами достоверно ( р < 0,01). В скобках - процент. ЦМВР был обнаружен у 15 пациентов с ВИЧ-инфекцией в стадии вторичных проявлений - 3В (СПИД). К моменту обнаружения давность заболевания варьировала от 5 дней до 2,5 мес. В отличие от ВИЧ-микроангиопатии ЦМВР практически у всех пациентов сопровождался нарушениями зрительных функций. Наиболее характерными (при первичной периферической локализации) были жалобы на дефект поля зрения, плавающие помутнения стекловидном теле. Реже отмечали нерезко выраженный болевой синдром цилиарного происхождения (у 4 больных). Нарушение зрительных функции отмечено у 5 пациентов - с локализацией поражения в центральных отделах глазного дна (3 больных), а также при наличии частичного гемофтальма и атрофии зрительного нерва. Предварительный диагноз во всех случаях был установлен по типичной офтальмологической картине - наличию очагов некротического ретинита белого цвета с геморрагиями, преимущественно располагавшихся по ходу крупных ретинальных сосудов. ЦМВ-этиология заболевания считалась подтвержденной при обнаружении высокого уровня ДНК ЦМВ (4+ и выше в периферической крови); это наблюдалось у всех пациентов с типичной офтальмологической картиной. Более доступный в обычной клинической практике тест - выявление антител к ЦМВ класса IgM - оказался в данной ситуации менее чувствительным. Эти антитела были найдены у 61% пациентов с высоким уровнем ДНК ЦМВ, причем при наблюдении в динамике титр антител у многих больных снижался, что, по-видимому, связано с прогрессирующей дезорганизацией иммунной системы вследствие развития СПИДа. Дополнительно в пользу ЦМВ-генеза заболевания свидетельствовал положительный результат терапии ганцикловиром (цимевеном) - одним из основных препаратов, применяемых для лечения серьезных проявлений ЦМВ-инфекции. У 12 пациентов с ЦМВР наступил летальный исход. У всех больных развивалась генерализованная манифестная ЦМВ-инфекция, которая явилась причиной их смерти. К моменту смерти двусторонняя слепота отмечена у 1 больного, не получавшего этиотропного лечения, во всех остальных случаях острота зрения (хотя бы на одном глазу) превышала 0,04. Исходы не прослежены у 3 больных. Клиническая картина острого ретинального некроза отмечена у одного пациента с инфекцией ВИЧ в 3В стадии. Наблюдались признаки некротического ретинита с центральной локализацией на обоих глазах (острота зрения 0,04 и 0,08 соответственно). Через 2 нед практически одновременно на обоих глазах произошло нарушение кровообращения 11 сосудах сетчатки по артериовенозому типу с полным прекращением ретинального кровотока и утратой зрительных функций, распад некротической ткани привел к формированию множественных дырчатых разрывов по периферии сетчатки и возникновению тотальной отслойки. Применение вазодилататоров, антикоагулянтов, а также гипербарической оксигенации не привело к восстановлению светоощущения, поэтому оперативное лечение отслойки сетчатки было признано бесперспективным. Этиология заболевания у данного пациента осталась неустановленной. Уровень ДНК ЦМВ не превышал 2+ и не повышался, на фоне терапии ганцикловиром положительной динамики не было. Не было выявлено ни IgM к вирусу простого герпеса и ЦМВ, ни ДНК указанных вирусов в диагностически значимых количествах. Так как по данным литературы [7,9, 11], чаще всего ретинальный невроз вызывается вирусами Herpes zoster и ЦМВ, то в этом случае, по-видимому, имело место очень быстрое развитие инфекции и не произошло накопления генетического материала вируса и антител в количестве, достаточном для их обнаружения в периферической крови. Только у нескольких пациентов отмечены осложнения со стороны переднего сегмента глаз, они включали древовидный герпетический кератит, герпетический иридоциклит, кератоконъюнктивит аденовирусной этиологии. По сравнению с аналогичными изменениями у пациентов с нормальным иммунным статусом отмечена более стертая симптоматика - отсутствие инъекции, слабовыраженный болевой синдром, а также длительное течение заболевания. После проведенного лечения, включавшего индукторы интерферонообразования и (при герпесвирусной патологии) ацикловир, у всех больных достигнуто излечение и восстановление исходной остроты зрения; рецидивов в срок до 6 мес не наблюдалось. Таким образом, примерно у 14% пациентов с ВИЧ-инфекцией наблюдаются изменения различных структур глаза, включая состояния, угрожающие зрению (особенно ЦМВР и острый ретинальный некроз). Поэтому пациенты с ВИЧ-инфекцией (особенно в стадии развития СПИД) должны находиться под постоянным наблюдением офтальмолога. Выводы 1. У больных ВИЧ-инфекцией часто развиваются поражения глаза вирусной этиологии, включая состояния, представляющие угрозу для зрения. Чаще всего выявляются ретинальная микроангиопатия (ватообразные очаги в 7,3% случаев и ретинальные геморрагии в 1,1%) и ЦМВР (4,1%). 2. Обнаружение у пациентов с глубоким иммунодефицитом ватообразных очагов в сочетании с активацией ЦМВ-инфекции (наличие ДНК ЦМВ в крови) является признаком угрозы манифестации этой инфекции в форме ретинита и/или серьезных экстраокулярных проявлений и, возможно. служит одним из критериев для начала профилактической этиотропнои терапии. 3. Нередкими осложнениями ЦМВР являются атрофия зрительного нерва, помутнение зрительного тела, поражение макулярной области, от слойка сетчатки. 1.1.МВР обычно диагностируются офтальмоскопически; подтверждающими признаками являются обнаружение высокого уровня ДНК ЦМВ в крови (методом ПЦР), а также положительный результат терапии антицитомегаловирусными препаратами. 4. В отдельных случаях ВИЧ-инфекция сопровождается вирусными поражениями переднего сегмента глаза (герпетическим кератитом и иридоциклитом), а также аденовирусным кератоконъюнктивитом. ЛИТЕРАТУРА 1. Жабоедов Г. Д.. Бондарева Г. С. // Вестн. офтальмолог., 1998 N 2. - С. 65-67. 2. Ильницкий В. А., Мануйлов Н. Н., Мелешенкова Т.И. // Там же. - 1990. - № 5. - С. 58-60. 3. Индейкин Е. Н. // Там же. - № 1. - С. 67-68. 4. Danner S. A. // AIDS. - 1995. - Vol. 9. - Suppl. 2 - Р. S3-S8. 5. Enger С., Jabs D. A., Dunn J. P. ct al. // Ophthal. Epidcmiol. - 1997..- Vol. 4, N 1. - P. 41-48. 6. Gonzalez C. R. , Wiley С. A., Arevalo J. F. et al. // Retina. - 1996. - Vol. 16, N 4. - Р. 305-311. 7. Jabs D. A. // Trans. Amer. Ophthal. Soc. - 1995. - Vol. 93. -P. 623-633. 8. Litwak А. В. // Optom. Vis. Sci. - 1995. - Vol. 72, N 5. -P. 312-319. 9. Moorthy R. S., Wemberg D. V., Teich S. A. ct al. // Brit. Ophthal. - 1997. - Vol. 81, N 3. - P. 189-194. 10. Musch D. S., Martin D. F., Gordon J. F. ct al. // New Engl. J. Med. - 1997. - Vol. 337, N 2. - P. 83-90. 11. Pavesio С. Е., Mitchell S. M., Barton К. ct al. // Eye. - 1995. -Vol.9, Pt3. - P. 271-276. 12. Sandy С. J., Bloom P. A., Graham E. M. et al. // Ibid. -P. 277-281. Поступила 26.05.98 Article 7.htm ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ- ИНФЕКЦИИ. К.А. Саркисян, Г.А. Шипулин, М.С. Воробьева, О.Ю. Шипулина, В.И. Шахгильдян, Л.В. Серебровская, В.В. Покровский. ГИСК им. Л.А. Тарасовича МЗ РФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва. В последнее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) все чаще применяется для обнаружения ВИЧ-1. Показано, что этот метод представляет особую ценность при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, а также лиц с неопределенными результатами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота (ИБ) (8, 11, 19). Ставится также вопрос о необходимости использования ПЦР, как дополнительного метода, при тестировании доноров органов и крови, а также препаратов крови с целью выявления образцов, взятых от ВИЧ-инфицированных лиц в период от инфицирования до сероконверсии, когда ИФА на антитела дает ложноотрицательные результаты (12). Несмотря на заманчивость использования метода ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции, внедрение его в практику отечественных лабораторных служб до сих пор не состоялось (4, 5). Зарубежный опыт показывает, что для этого необходимо решение следующих задач (7,14): разработки недорогой, эффективной и доступной для практического здравоохранения ПЦР-тест-системы, а также апробации ее на как можно большом числе проб крови от ВИЧ-инфицированных пациентов, выявляемых на данной территории; формирования стандартной панели из изолятов ВИЧ-1, циркулирующих на данной территории, - с целью проверки эффективности их обнаружения праймерами, входящими в состав ПЦР-тест-системы; введения системы слежения за эффективностью работы диагностических ПЦР-лабораторий центральной ПЦР-лабораторией, посредством регулярного предоставления им зашифрованных образцов. В то же время, коммерческие ПЦР-тест-системы для выявления ВИЧ-1, появившиеся недавно за рубежом, несмотря на удобство работы с ними, вряд ли будут востребованы в ближайшее время отечественным здравоохранением по причине, главным образом, крайне высокой стоимости. Еще одна причина, ставящая под сомнение целесообразность их применения в настоящее время на территории Российской Федерации, связана с возможностью высокого числа ложноотрицательных результатов при тестировании российских ВИЧ-инфицированных пациентов, у которых показана высокая степень гетерогенности субтипов ВИЧ-1 (1). В связи с этим, ранее нами была предпринята попытка разработки оригинальной ПЦР-тест-системы для выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 в крови ВИЧ-инфицированных пациентов (6). Настоящая работа представляет собой следующий шаг в изучении чувствительности и специфичности указанной ПЦР-тест-системы при ее апробации на клиническом материале. Мы также задались целью проанализировать основные причины ложноотрицательных результатов, наблюдаемые в отдельных случаях при тестировании сероположительных лиц на ДНК ВИЧ-1 методом ПЦР. Материалы и методы Пациенты. В период с 1994 по 1996 гг. проводили обследование среди пациентов Российского Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом с диагнозом ВИЧ-инфекция. Было изучено 175 образцов крови от 107 пациентов - жителей европейской части Российской Федерации. Наличие антител к ВИЧ-1 подтверждали с помощью ИФА-тест-систем фирм и верифицировали методом ИБ фирмы .... У всех пациентов определяли концентрацию CD4-лимфоцитов с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США) методом проточной цитофлуорометрии. Максимальное, минимальное и среднее значения концентрации С04-лимфоцитов на 1 мкл составили у обследованных пациентов, соответственно, -. Стадию ВИЧ-инфекции определяли согласно классификации В.И. Покровского (2). Из 107 пациентов у ... была диагностирована ВИЧ-инфекция в стадии первичных проявлений (ПБ и ПВ), у ... - в стадии вторичных заболеваний (ША), у - ШБ и у -ШВ (СПИД). Контрольную группу составили 100 доноров крови не имеющих антител к ВИЧ-1, в возрасте от 20 - 59 лет. Подготовка проб крови. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-гепак (Фармация, Швеция). 106 клеток ресуспендировали в 100 мкл лизирующего буфера по Kawasaki (18). Лизис клеток проводили при 56 °С в течение 30 мин с последующей инактивацией протеиназы. Для ПЦР брали 10 мкл лизата. Проведение ПЦР и детекции продуктов ПЦР с использованием ПЦР-тест-снстемы. ПЦР-тест-система (ДНК-ВИЧ-1-тест) - препарат отечественного производства, разработана в ЦНИИ эпидемиологии (экспериментальная серия). Тест-система состоит из трех наборов: набора для подготовки проб крови к ПЦР, набора для проведения ПЦР и набора для детектирования продуктов ПЦР, В набор для подготовки проб крови к ПЦР входят все необходимые реагенты для выделения мононуклеарных клеток и их лизиса по Kawasaki (16). В набор для проведения ПЦР входят реагенты необходимые для ПЦР, в том числе биотинилированные праймеры комплементарные области gag ВИЧ1, фланкирующие фрагмент длиной 470 нуклеотидов. Праймеры были выбраны с помощью анализа 87 выровненных нуклеотидных последовательностей области gag ВИЧ1, относящихся к субтипам А, В, С, D, Е, F и G. В набор для детектирования продуктов ПЦР входят реагенты для проведения гибридизационно-ферментного выявления продуктов ПЦР в лунках иммунологических планшет, покрытых одноцепочечным зондом, комплементарным области фланкируемой праймерами. Все этапы ПЦР-анализа выполняли согласно инструкции, прилагаемой к набору. Пробу считали положительной в ПЦР если оптическая плотность превышала 0,35 О.Е.. После проведения 40 циклов амплификации 10 мкл амплификационной смеси дополнительно анализировали методом агарозного гель-электрофореза (20). Чувствительность ПЦР-анализа определяли для обоих методов детекции ампликонов как процент положительных проб крови, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов. Специфичность ПЦР-анализа для обоих методов детекции ампликонов определяли как процент отрицательных в ПЦР проб крови взятых от серонегативных доноров. Анализ ложноотрицательных результатов ПЦР, полученных при апробации тест-системы. Образцы крови, положительные в ИФА на антитела к ВИЧ-1 и дававшие отрицательные результаты в ПЦР-тест-системе подвергали дополнительному ПЦР-анализу в варианте двухстадийной амплификации (Nested PCR) с праймерами ED3/ED14 в первом раунде (35 циклов) и ED5/ED12 во втором раунде ПЦР (35 циклов), любезно предоставленными проф. Д. Мюллинсом из группы по выделению и характеристике ВИЧ-1 при ВОЗ, При отсутствии положительного сигнала с внутренними праймерами амплификационную смесь после первого раунда ПЦР подвергали амплификации с другими внутренними праймерами - ED31/ED33 или ES7/ES8. Данная система праймеров была разработана Delwart и сотр. для субтипирования изолятов ВИЧ-1 методом анализа подвижности гетеродуплексов и позволяет амплифицировать любую из известных на сегодня разновидность ВИЧ-1 (9). В ПЦР брали ДНК выделенную методом фенол-хлороформной экстракции в количестве эквивалентном 1О5 мононуклеарных клеток. Пригодность выделенной ДНК к ПЦР подтверждали путем амплификации с дополнительной парой праймеров к гену в-субъединицы терминального компонента комплемента С8 (16). В последнем случае брали в ПЦР 1,5 мкг ДНК и проводили 25 циклов ПЦР согласно Zazzi и соавт. (23). Результаты и обсуждение. Высокая вариабельность ВИЧ-1 в сочетании с крайне низкой нагрузкой провирусной ДНК в периферической крови (10 геномов провируса ВИЧ-1 на 105-107 мононуклеарных клеток) определяют основные проблемы, возникающие при разработке методик для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью ПЦР (15, 21). Большинство методологий, применяемых для решения этих проблем в научно-исследовательских лабораториях, несмотря на их эффективность, вряд ли когда-либо будут востребованы для практических целей по причине их трудоемкости, дороговизны и необходимости большого опыта и навыков в работе с ними (4). В предыдущей работе мы предложили оригинальный подход к разработке ПЦР-диагностикума, взяв за основу схему нерадиоактивной гибридизационно-ферментной детекции меченных биотином продуктов ПЦР (Рис. 1) (6). На количественном ДНК стандарте ВИЧ-1 была продемонстрирована высокая чувствительность разработанной ПЦР-тест-системы, позволявшая выявлять в модельных условиях единичные молекулы провирусной ДНК ВИЧ-1 при нагрузке геномной ДНК человека эквивалентной 105 лейкоцитов. Выгодными характеристиками разработанной ПЦР-тест-системы являются также низкая себестоимость производства и то, что гибридизационно-ферментный метод в техническом исполнении напоминает ИФА и может быть легко освоен сотрудниками практической ИФА-лаборатории. Т. обр., перспективность данной разработки привела к необходимости провести расширенные испытания ее чувствительности и специфичности на клиническом материале. Для решения этой задачи нами были проанализированы 175 образцов крови от 107 ВИЧ-инфицированных пациентов, наблюдавшихся в Федеральном центре по профилактике и борьбе со СПИД ом и 200 проб крови от 100 доноров крови (отрицательных по результатам тестирования на антитела к ВИЧ-1 в ИФА). Сравнивали влияние способа детекции продуктов ПЦР на эффективность ПЦР-анализа. При использовании электрофоретического метода детекции ампликонов чувствительность ГЩР-анализа равнялась - 89%, а специфичность - 91%. Причиной большого числа ложноотрицательных результатов в этом случае может быть недостаточная чувствительность электрофоретического способа детекции ампликонов. Причиной ложноположительных результатов является принципиальная невозможность с помощью гель-электрофореза различать продукты специфической и неспецифической амплификации в случае, если они имеют одинаковую или близкую длину (7). При использовании гибридизационно-ферментного метода детекции ампликонов специфичность тест-системы составила - 100%. Высокую специфичность ПЦР-анализа, полученную в настоящей работе, мы объясняем прежде всего правильной организацией проведения работ в нашей лаборатории, исключающей возможность контаминации (3), а также специфичностью выбранных праймеров. Альтернативой гибридизационно-ферментному методу детекции часто считают амплификацию с дополнительной парой праймеров. Основным недостатком этого подхода, по сравнению с использованным нами, является повышенный риск загрязнения рабочих поверхностей продуктами первого раунда ПЦР и, следовательно, снижения специфичности анализа. Для предотвращения ложноположительных реакций в этом случае рекомендуется проводить второй раунд ПЦР в отдельном ламинарном шкафе и включать до 50% отрицательных контрольных проб в каждый опыт, что существенно затрудняет проведение такого ПЦР-анализа (10). Чувствительность нашей ПЦР-тест-системы при использовании гибридизационно-ферментного варианта детекции ампликонов составила -96% (7 отрицательных реакций из 175 выполненных). Заявляемая чувствительность аналогичных ПЦР-тест-систем для выявления провирусной ДНК ВИЧ1, например, фирмы равна 99,9%. Однако недавно проведенные исследования показывают, что показатели чувствительности для данной тест-системы зависят от того, из какой страны были получены протестированные пробы крови (13, 22). Так, при тестировании с помощью ПЦР-набора этой фирмы проб крови от ВИЧ-инфицированных из Уганды чувствительность не превышала 70%, что объясняют распространенностью на данной территории субтипов А и Д, которые плохо выявляются праймерами, входящими в состав данной тест-системы (22). Высокая изменчивость ВИЧ-1 - частая, но не единственная причина возникновения ложноотрицательных результатов ПЦР. В настоящее время имеются суммарные данные по выявлению провирусной ДНК у более чем 2000 ВИЧ-инфицированных пациентов, свидетельствующие о том, что до 3% лиц с ВИЧ-инфекцией имеют крайне низкую концентрацию ДНК ВИЧ1 в крови и не могут быть выявлены с помощью большинства из существующих ПЦР-методик (23). В нашем случае из 107 проанализированных пациентов у шестерых был получен хотя бы один раз отрицательный результат (5,6%). Характеристика этих пациентов приведена в таблице 1. У трех пациентов были получены дискордантные от пробы к пробе результаты (2,8%), один был отрицателен при повторном тестировании (0,9%) и два пациента, для которых при первичном тестировании были получены ложноотрицательные результаты, не подвергались повторному исследованию (1,9%). Следовательно у большинства пациентов (75%) из этой группы, для которых имелось несколько проб крови, провирусная ДНК могла быть выявлена праймерами входящими в состав тест-системы, а ложноотрицательных реакции были следствием низкой нагрузки провирусной ДНК, выходящей за пределы чувствительности нашей тест-системы. С целью дополнительного анализа причин ложноотрицательных реакций на пробах, для которых были получены отрицательные результаты при использовании ПЦР-тест-системы, была проведена амлификация в варианте двухстадийной ПЦР с праймерами, которые должны амплифицировать практически все из известных субтипов ВИЧ-1 (9). Причем предел измерения такого варианта ПЦР-амплификации позволяет выявлять 1-10 молекул провируса в пробе в присутствии 106 эукариотических клеток. Результаты последнего тестирования полностью совпали с результатами, полученными с помощью ПЦР-тест-системы (Табл.1). Отсюда можно сделать вывод о том, что основной причиной ложноотрицательных результатов при испытании ПЦР-тест-системы могла быть низкая концентрация ДНК провируса в некоторых пробах крови. Полученные нами данные хорошо согласуются с данными Tosswill и соавт., которые при анализе причин ложноотрицательных реакций ПЦР-тест-системы фирмы с помощью секвенирования изолятов ВИЧ-1, из сероположительных образцов крови, давших отрицательный в ПЦР результат, обнаружили, что практически в 100% случаев низкая концентрация ДНК провируса, а не мутации в местах узнавания праймеров, обусловливали появление ложноотрицательныхрезультатов (22). В другой работе, при исследовании 553 образцов мононуклеарных клеток от ВИЧ-инфицированных пациентов методом двухстадийной ПЦР, было доказано, что в 80% случаев ложноотрицательные результаты ПЦР на ВИЧ-1 были вызваны низкой нагрузкой провирусной ДНК, а в 20% случаев причины не были установлены (23). Т. обр., проведенные исследования показывают, что показатели чувствительности и специфичности нашей ПЦР-тест-системы при ее апробации на материале от Российских пациентов с ВИЧ-инфекцией и доноров крови составляют, соответственно, - 96% и 100%. Причем основной вклад в увеличение этих показателей внесло использование гибридизационно-ферментной схемы детекции продуктов ПЦР, т. к. электрофоретический метод учета результатов ПЦР давал 9% ложноположительных и 11% ложноотрицательных результатов. Основной причиной ложноотрицательных реакций при применении апробированной ПЦР-тест-системы, как показала двухстадийная амплификация с праймерами узнающими все из известных субтипов ВИЧ-1, была низкая концентрация провирусной ДНК ВИЧ-1 в некоторых пробах крови. Таблица 1. Характеристика пациентов с ВИЧ-инфекцией для которых были получены ложноотрицательные или дискордантные от пробы к пробе результаты ПЦР. Пациенты № Пробы № Концентрация CD4-клеток (кл/мкл) Стадия ВИЧ-инфекции Результаты тестирования проб с помощью ПЦР-тест-системы Результаты тестирования проб в двухстадийной ПЦР по Delwart и соавт. 1 la 490 За положительный н/и 16 н/д За отрицательный отрицательный 2 2а ИЗО 26 отрицательный н/и 26 10 Зв положительный отрицательный 3 3 1160 26 отрицательный отрицательный 4 4а 70 За отрицательный отрицательный 46 140 За отрицательный отрицательный 5 5а 180 36 положительный н/и 56 Н/Д 36 отрицательный отрицательный 6 6 990 26 отрицательный отрицательный Примечание. Н/д - нет данных. Н/и -не исследовали. ЛИТЕРАТУРА. 1. Бобков А.Ф, Покровский В.В, Селимова Л.М, и др. // Вопросы вирусологии.-1997.-? -с. 13-16. 2. Покровский В.И. // ВИЧ-инфекция или СПИД? // Тер. архив. - 1989. - ? 11. -с.3-6. 3. Покровский В.В, Федоров Н.А, Шипулин Г.А. и др. // Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения. // 1995. 4. Радюк С.Н, Мацевич Г.Р, Анджапаридзе О.Г и др. // Вопросы вирусологии.-1994.-? -с. 53-56. 5. Радюк С.Н., Мацевич Г.Р., Анджапаридзе О.Г. // Вопросы вирусологии.- 1994.-?-с.99-101. 6. Шипулин Г.А., Саркисян К.А., Шипулина О.Ю. и др. // Матер. VII съезда ВОЭМиП. - т. 1.- c.397-398. 7. Bootman J.S. Kitchin P.A. // J. of Virol. Methods. - 1992. - Vol. 37. - P. 32-42. 8. Celum C.L., Coombs R.W., Jones M. et. al. // Arch. Jntem. Med. - 1994. - Vol. 154. - P. 1129-1137. 9. Delwart L.E., Shpaer E.G., Louwagiae J. //Science, -1993. -Vol. 262. -P. 1257-1261. 10. Ehmst A., Einsele Ш/ Scand. J. Infect. Dis. Suppl. -1995. -Vol. 99. -P. 16-18. 11. Gin АД Litto F.B, McDermott J.L. et. al. // J. Med. Virol. -1994. - Vol 42, - P. 414-419. 12. dark S.J, Kelen G.D, Henrard D.R. et.al. // J. Infect. Dis. - 1994. - Vol. 170. - P. 194-197. 13. Jackson J.B, Piwowar E.M, Parsons J. et al. // J. ofClin. Microbiol. -1997. - Vol. 35. -P.873-876. 14. Jackson J.B, Drew J, Hsians Ju Lin, Otto P. et al // J. ofClin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31. -P. 3123-3128 15. Jurriaans S, Dekker J.T, A. de Ronde // AIDS.-1992. - Vol. 6. - P. 635-641. 16. KaufinannT.G., Hansch G., Rittner С.// J. hnmunol.-1993. -Vol. 150. -P. 4943-7. 17. Kawai S, Maekawajin S, Yamane A. // Anal. Biochem.- 1993. -Vol. 209.- P. 63-69 18. Kawasaki E.S. // In PCR protocols: A guide to methods and applications. -Academic Press. San Diego. - 1980. - P. 146-152. 19. Migali E, Mariotti D, Lovari A. Et. al. // Allergol. Immunopathol. Madr - 1993. - Vol. 21. -P 61-66. 20. Sambrook J., Fritch E, F., Maniatis T. //Molecular cloning. -Cold Spring Harbor Press, New York, 1989.- P. 6,9-6,16. 21. Simmonds P, Baife P, Peutherer J.F. // J. Virol.- 1990.- Vol 64. - P. 864-872 22. Tosswill J. H, Barlow K.L, Parry J.V. et al. // The Lancet -1994. - Vol. 343. - P. 1431. 23. Zazzi M., Romano L., Catucci M. et al. // J. of din. Microbiol. -1995. Vol. 31. -P.205-208. Article 8.htm УДК 619:576.8.078:616.981.42 ИДЕНТИФИКАЦИЯ БРУЦЕЛЛ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) К. В. ШУМИЛОВ, О. Д. СКЛЯРОВ, И. Л. ОБУХОВ, К. Н. ГРУЗДЕВ вгнки Г. А. ШИПУЛИН, О. Ю. ШИПУЛИНА цнииэ Успех борьбы с бруцеллезом зависит от скорости выявления всех инфицированных животных. При диагностике бруцеллеза в ветеринарной практике используют такие методы, как бактериологический, серологический, реже аллергический. Однако ни один из них самостоятельно при однократном исследовании не позволяет выявлять всех больных. Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного. Срок бактериологического исследования составляет 15-30 дней, а при постановке биологической пробы он увеличивается вдвое [2, З]. Диагностическая ценность серологических методов снижается из-за перекрестных реакций между Brucella abortus и Yersinia enterocolitica, серовариант 0:9, Pasteurella, Vibrio и другими бактериями [7, 8]. Положительные результаты отмечают при серологическом исследовании здоровых животных, вакцинированных против бруцеллеза. Дифференциальная диагностика бруцеллеза возможна при исследовании сыворотки крови животных в реакции иммунодиффузии в геле агара с 0-ПС антигеном ИЭВСиДВ. Однако по чувствительности этот метод уступает комплексу классических серологических реакций [1]. Изыскание новых быстрых, специфичных и высокочувствительных методов диагностики бруцеллеза является актуальной задачей. Достижения современной биотехнологии позволяют, используя молекулярно-генетические подходы, разрабатывать сверхчувствительные способы диагностики разных болезней. Одним из таких является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) или реакции энзиматической амплификации in vitro, предложенной в 1983 году американским ученым К. Б. Мюллисом. Суть его заключается в быстром многократном увеличении с помощью ДНК-полимеразы количества копий специфичного фрагмента генома бактерий, располагающегося между двумя специфичными олигонуклеотидными праймерами (затравками для синтеза ДНК), с последующей регистрацией результатов реакции гельэлектрофорезом или с помощью гибридизационно- ферментного анализа. В 1990 году D. Fekete et al. впервые применили метод ПЦР для детекции бруцелл, позднее некоторые ученые сообщили об успешном использовании данного метода для родовой и видовой идентификации этих микроорганизмов [4, б]. Однако почти во всех работах исследовали лишь клеточные лизаты бактерий, а не патологический материал от искусственно или естественно зараженных животных. Мало данных об эффективности ПЦР по сравнению с другими методами диагностики бруцеллеза. Цель нашей работы - изучение чувствительности и родовой специфичности метода ПЦР (в варианте двухшаговой реакции с вложенными праймерами, комплементарными гену BCSP31 Brucella) по сравнению с бактериологическим. Материалы и методы. В эксперименте использовали: агаровые культуры штаммов (каждого отдельно) Br. abortus 19, 82, 104М; Br. melitensis Rev-1; Br. ovis 424/2 и Y. enterocolitica, серовариант 0:9, суспендированные в физиологическом растворе в концентрации от 10 до 109 м. к/см3 (с шагом разведения, кратным десяти); пробы молока и крови (по 0,3 см3), контаминированные 0,1 см3 суспензии культуры Br. abortus 19 с концентрацией бруцелл 109 м. к/см3; патологический материал (селезенка, печень) от 14 морских свинок, убитых через 20 дней после иммунизации их культурами Br. abortus 19 (п=7) и 104М (п=7) в дозе 109 м. к. Отрицательным контролем служили пробы селезенки и печени от морской свинки, не иммунизированной бруцеллами; стерильный физиологический раствор; молоко и кровь, не контаминированные бруцеллами. Материал от иммунизированных и контрольной морских свинок исследовали бактериологически по общепринятой методике. Для проведения ПЦР каждую пробу от животных брали отдельным набором инструментов. Кусочек органа размером 0,5 см3 помещали в одноразовую пластиковую пробирку, добавляли 1 см3 физиологического раствора и тщательно растирали отдельной стеклянной палочкой. Гомогенат отстаивали 30 мин при комнатной температуре, затем верхнюю фазу переносили в пробирку вместимостью 1,5 м3 и 10 мин центрифугировали на центрифуге <Элми> при 11 тыс. об/мин. Супернатант отбрасывали, а осадок суспенди-ровали в 0,1 см3 физиологического раствора и использовали для выделения ДНК методом селективной сорбции [5]. Для этого к каждой пробе добавляли 0,3 см3 лизирующего раствора и 0,03 см3 сорбента. Объем проб физиологического раствора, молока и крови, контаминированных и не контаминированных бруцеллами, был идентичным. Смесь встряхивали 10 мин и центрифугировали, промывая отмывочным раствором от белков и солей. ДНК элюировали в 0,03 см3 деионизированной воды. ПЦР проводили на амплификаторе СТ-2. 0,01 см3 элюата смешивали с 0,05 см3 реакционного буфера, содержащего: трис-НСl 6,7 мМ (8,4); 16,7 мМ (NH4)2SO4; 0,02 М b-меркаптоэтанола; 0,2 мМ дезоксинуклеотоидтрифосфатов; 3 мМ MgClz и 0,12 mg/см3 BSA. К смеси добавляли 10 пмоль каждого праймера, 2,5 ЕД Тад-полиме-разы и вазелиновое масло. После 30 циклов амплификации с первой парой праймеров (внешних) провели еще 30 циклов со второй парой праймеров (внутренних). Праймеры подбирали с помощью компьютерной программы , учитывая последовательности нуклеотидов гена, кодирующего поверхностный иммуногенный белок клеточной стенки бруцелл, депонированного в банке генов под № М20404. Амплифицированную ДНК разделяли электрофоретически в 1,5 %-ном геле агарозы с трис-боратным буфером в присутствии бромида этидия. Результаты регистрировали, просматривая гепь в ультрафиолетовом свете. k В качестве положительного контроля использовали ДНК Br. abortus, штамм 544 (10 геномов на каждый контроль), отрицательного - 0,2 мкг/мкл ДНК тимуса быка (). Результаты исследования и обсуждение. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и универсальности метод ПЦР все чаще применяют для диагностики инфекционных болезней. Максимальная эффективность ПЦР достигается при соблюдении определенных условий. Это использование такого способа подготовки клинических проб, который не снижал бы показатели чувствительности и специфичности метода, правильные выбор праймеров и метод детекции продуктов ПЦР. Таблица 1 Чувствительность и специфичность ПЦР Исследуемый материал Количество м.к/см3 107 106 105 104 103 102 10 Суспензия бруцелл, штамм 19 + + + + + + - Суспензия иерсиний, серовариант 0:9 - - - - - - Стерильный физиологический раствор - - - - - - Контроль - ДНК Br. abor-tus, штамм 544 + + + + + + Примечание. "+" - положительный результат, "-" - отрицательный. Таблица 2 Специфичность ПЦР Исследуемый материал Концентрация з м.к/см" Результат Суспензия Br. abortus, штамм 19 104 + Br. abortus, штамм 19 10е + Br. abortus, штамм 82 104 + Br. abortus, штамм 82 10е + Br. abortus, штамм 104М 104 + Br. abortus, штамм 104М 108 + Br. melitensis, штамм Rev-1 104 + Br. melitensis, штамм Rev-1 108 + Br. ovis, штамм 424/2 104 + Br. ovis, штамм 424/2 10в + Y. enterocolitica, серовари-ант 0 : 9 104 Y. enterocolitica, серовари-ант 0 : 9 10е Молоко, контаминированное Br. abortus, штамм 19 10е + Кровь, контаминированиая Br. abortus, штамм 19 10е + Молоко - - Кровь - - Физиологический раствор - - Контроль - ДНК Br. abortus, штамм 544 10 геномов + Примечание. <+> - положительный результат, <-> - отрицательный. Таблица 3 Чувствительность метода ПЦР и бактериологического метода исследования Мг морской свинки Иммунизированны культурой Br. abortus, штамм Результаты ПЦР бактериологическое исследование селезенка печень селезенка печень 11 104М + + + - 12 104М + + + + 13 104М + + + + 14 104М + + + + 15 104М + + + + 16 104М + + + - 17 104М + + + + 18 19 + + + - 19 19 + + + - 20 19 + + + - 21 19 + + + - 22 19 + + + + 23 19 + + + + 24 19 + + + - 25 Не иммунизировали - - - - Контроль - ДНК Br. abortus, штамм 544 + + Примечание. <+> - положительный результат,<-> - отрицательный. Для подготовки проб к проведению ПЦР использовали метод экстракции ДНК, который неоднократно применяли как первый этап ПЦР-диагностики многих инфекций, но не бруцеллеза. Он позволяет концентрировать препараты ДНК и одновременно очищать их от ингибиторов ПЦР. При диагностике бруцеллеза с помощью ПЦР мы исходили из того, что одностадийный вариант реакции с последующей электрофоретической детекцией ампликонов, часто используемый для научно-исследовательских целей, позволяет достичь максимальной чувствительности ПЦР (5-10 молекул) только при работе с высокоочищенными исходными препаратами ДНК. Использование радиоактивных методов регистрации результатов ПЦР, часто встречающееся в работах зарубежных авторов, мы считаем бесперспективным. Потому для детекции продуктов ПЦР применяли метод, предусматривающий проведение повторной амплификации продуктов первой стадии с вложенными (внутренними по отношению к внешним) прайме-рами. Правильность данной стратегии подтвердили результатами исследований на модельных системах и при сравнении с бактериологическим методом диагностики бруцеллеза у экспементально инфицированных животных. С помощью ПЦР установили наличие ДНК бруцелл в суспензиях их с концентрацией от 102 до 107 м-к/см3 (табл. 1). Так как для приготовления клеточных лизатов испытуемые пробы брали в объеме 0,1 см3, следовательно, с помощью ПЦР удавалось быстро подтвердить наличие бруцелл в пробе, содержащей около 10 микробных клеток. При исследовании проб суспензии иерсиний, содержащих от 10 до 10"-к/см3, все результаты были отрицательными. Отмечали соответственно отрицательную и положительную ПЦР при исследовании стерильного физиологи-s ческого раствора и ДНК Br. abortus, штамм 544. Родоспецифичность данного метода подтвердили положительные результаты, полученные при исследовании суспензий культур Br. abortus 19, 82, 104М; Br. melitensis Rev-1; Br. ovis 424/2, и отрицательные при анализе проб культур Y. enterocolitica, сёрова-риант 0:9. С помощью ПЦР установили наличие ДНК бруцелл во всех суспензиях независимо от вида и концентрации их, а также в пробах молока и крови, контаминированных Br. abortus. Стерильный физиологический раствор, молоко и кровь, не контаминирован-ные бруцеллами, дали отрицательные результаты (табл. 2). Сравнительное изучение чувствительности ПЦР и бактериологического метода исследования показало, что с помощью ПЦР наличие ДНК бруцелл установили во всех пробах селезенки и печени морских свинок, кроме' контрольной (табл. 3). При бактериологическом исследовании культуры бруцелл выделили из всех проб селезенки и из 7 проб печени (? 12, 13, 14, 15, 17, 22, 23) иммунизированных морских свинок, а также зарегистрировали отрицательный результат при изучении материала от неиммунизированной морской свинки. ПЦР, как минимум, подтверждает все положительные результаты бактериологического метода, а с учетом данных исследования проб печени чувствительность первого была в 2 раза выше. Заключение. Метод ПЦР специфичен и высокочувствителен. Он позволяет в течение одного рабочего дня подтвердить наличие бруцелл в разных жидкостях (физиологический раствор, молоко, кровь), контаминированных небольшим количеством возбудителя, а также в патологическом материале от инфицированных бруцеллами животных. ЛИТЕРАТУРА 1. Антонов Б. И. и др. // Ветеринария, 1994. 11. 2. Журнакова М. А. // Сборник трудов ЛенНИВИ. 1959. 3. Штритер В. А. и др. // Труды экспедиции ВИЭМ. 1937. 4. Baily G. G. // J. Trop. Med. Hyg. 1995. 5. Boum J. et al. // J. Clin. microbiol. 1980. 28. 6. Fekete D. et al. // J. Appl. Bacteriol. 1990. 7. Corbel M. J. // 3rd Int. Symp. Brucellosis, Algiers, 1983; Basele a. 1984. 56. 8. Popovic M., Trbic В. // Vet. Glasnik. 1983. 37. Identification of brucelles by means of a polymerase chain reaction (PCR) K. V. Shumilov, 0. D. Skliarov, I. L. Obukhov, K. N. Gruzdev, G. A. Shipulin, 0. Yu. Shipulina SUMMARY The PCR method is specific and highly sensitive. It enables during one working day confirmation of presence of brucelles in various liquids contaminated with small amount of a contagium as well as in pathological material from animals infected with brucelles. Article 9.htm ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (C) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК 615.281.8.03:616.98:578.828.6].036 А. В. Кравченко, Л. В. Серебровская, Е. Л. Голохвастова, Г. А. Шипулин, Е. В. Богословская, Э. С. Горбачева ТИМАЗИД В СОЧЕТАНИИ С ХИВИДОМ И ИНВИРАЗОЙ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ С ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ Российский научно-медицинский центр по профилактике и борьбе со СПИДом; Московский городской центр по профилактике и борьбе со СПИДом Лечение больных с ВИЧ-инфекцией остается одной из наиболее сложных проблем современной медицины. Международное научное общество по лечению больных с ВИЧ-инфекцией ежегодно пересматривает свои рекомендации [2]. С середины 80-х годов лечение больных с ВИЧ-инфекцией осуществляли с помощью лекарственных средств - модифицированных нуклеозидов (ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ). Однако уже в начале 90-х годов были опубликованы результаты по созданию нового класса антиретровирусных препаратов - ингибиторов протеазы [1]. Саквинавир (инвираза) был первым препаратом данного класса, разрешенным к применению в США в декабре 1995 г. [4]. Многочисленные исследования, проведенные за рубежом, убедительно доказали терапевтическую эффективность саквинавира, в особенности при использовании его в комбинации с двумя препаратами - ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ [3, 5, б]. Наше исследование (открытое несравнительное) является первым опытом лечения в России больных с ВИЧ-инфекцией комбинацией из трех антиретровирусных препаратов - саквинавира с зальцитабином и азидотимидином. Целями настоящего исследования были оценка эффективности саквинавира в комбинации с зальцитабином и азидотимидином в лечении ВИЧ-инфицированных больных, ранее не получавших противоретровирусной терапии или получавших азидотимидин не более 6 мес; изучение характера, частоты, тяжести, продолжительности, связи с лечением и исхода всех нежелательных явлений. Материалы и методы В исследование включали мужчин и женщин европейской расы в возрасте от 18 до 60 лет с доказанной ВИЧ-инфекцией, у которых количество С04-клеток находилось в пределах от 50 до 500 в 1 мкл, отсутствовала предшествующая противоретровирусная терапия или противоретровирусная терапия не более 6 мес. Больной давал письменное информированное согласие об участии в исследовании и выполнении его требований. Протокол исследования одобрен этическим комитетом Центрального НИИ эпидемиологии Минздрава РФ. Препараты назначали постоянным курсом по следующей схеме: азидотимидин (тимазид, НПО "АЗТ", Россия) - 600 мг/сут (2 капсулы по 0,1 г 3 раза в день) + зальцитабин (хивид, "Hoffman La Roche", Швейцария) - 2,25 мг/сут (2 таблетки по 0,375 мг 3 раза в день) + саквинавир (инвираза, "Hoffman La Roche", Швейцария) - 1800 мг/сут (3 капсулы по 200 мг 3 раза в день). Эффективность лечения оценивали по наличию или отсутствию клинических признаков прогрессии ВИЧ-инфекции, динамике концентрации РНК ВИЧ-1 в плазме и количества СВ4-лимфоцитов в сроки О, 1, 2, 3 и 4 мес лечения. Концентрацию РНК ВИЧ-1 в плазме определяли методом количественной полимеразной цепной реакции (Ампликор, "Hoffmaii La Roche", Швейцария). Нижний предел определения равен 400 копиям РНК ВИЧ-1 в 1 мкл плазмы. Число С04-лимфоцитов подсчитывали при помощи проточной цитофлюорометрии, используя моноклональные антитела ("Becton Diskinson", США). При каждом визите у пациентов исследовали показатели периферической крови и биохимические параметры: содержание билирубина, креатинина, глюкозы, уровни АсАТ, АлАТ, ЩФ, амилазы крови. С октября 1997 г. по апрель 1998 г. в исследование были включены 32 пациента (29 мужчин, 3 женщины) в возрасте 23-59 лет (средний возраст 34,6 ± 1,6 года). Закончили исследование 28 пациентов (4 человека исключены на 2-м месяце лечения из-за нарушения комплаентности). У пациентов диагностированы следующие стадии ВИЧ-инфекции: у 1 больного 2А (острая ВИЧ-инфекция, мононуклеозоподобный синдром), у 17 2Б, В, у 13 ЗА, у 1 ЗБ. У больных на стадиях ВИЧ-инфекции ЗА и ЗБ на момент включения в исследование не было никаких клинических проявлений заболевания. Количество С04-клеток колебалось от 70 до 490 в 1 мкл (среднее количество 230 ± 20, медиана 210). Концентрация РНК ВИЧ варьировала в пределах 400- 930 000 копий в 1 мл (среднее количество 175 344 ± 104 173, медиана 16 000). Результаты и обсуждение За период наблюдения (4 мес) ни у одного пациента не наблюдали клинических признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции. У больного с острой ВИЧ-инфекцией в течение первых 2 нед лечения нормализовалась температура тела, уменьшились размеры лимфатических узлов, полностью восстановилась работоспособность. Среди 14 пациентов, у которых установлены стадии вторичных заболеваний ЗА и ЗБ, на 1-м месяце лечения в 1 случае наблюдался рецидив инфекции, обусловленной Herpes simplex, в другом - остеофолликулит. Рис. 1. Динамика количества С04-лимфоцитов (медиана) при комбинированной антиретровирусной терапии. Здесь 11 на рис. 2 по оси абсцисс - срок лечения (в мес). Рис. 2. Динамика количества РНК ВИЧ (медиана) при комбинированной антиретровирусной терапии. Частота острых вирусных респираторных инфекций среди пациентов всей группы варьировала от 3,6 до 10,7% ежемесячно. Таким образом, за период с октября 1997 г. по апрель 1998 г. менее 30% ВИЧ-инфицированных больных перенесли ОРВИ. У 2 пациентов ОРВИ осложнилась обострением хронического гайморита, у 1 - хронического бронхита. Через 1 мес лечения среднее количество CD4-лимфоцитов увеличилось на 65 клеток и составило 295 ± 31 клетка в 1 мкл, через 2 мес - 329 ± 33 (до лечения 230 ± 20; р < 0,05). Максимальное увеличение числа С04-клеток наблюдали через 3 мес от начала лечения - 394 ± 36 клеток в 1 мкл (р < 0,01), сохранявшееся на том же уровне и к концу исследования - 361 ± 34 клетки в 1 мкл (р < 0,01 по сравнению с данными до начала исследования). Динамика количества С04-лимфо-цитов (по медиане) в процессе комбинированной терапии представлена на рис. 1. Среднее содержание РНК ВИЧ в плазме через 1 мес от начала исследования снизилось в 2 раза (с 175 344 копий в 1 мл до 86 479), а в дальнейшем варьировало в пределах 2600-13 000 копий в 1 мл. Динамика количества РНК ВИЧ (по медиане) в процессе комбинированной терапии представлена на рис. 2. Среди нежелательных явлений, связанных с проводимой терапией, с наибольшей частотой встречались тошнота слабой степени выраженности (по-видимому, связанная с приемом тимазида) у 21,9% больных на 1-м месяце лечения и у 10,7% на 2-м (рвоты не наблюдали ни у одного больного); полуоформленный стул 1-2 раза в сутки у 15,6% больных на 1-м месяце и у 3,6% на 2-м; снижение аппетита и изменение вкуса у 6,3% пациентов на 1-м месяце лечения. У 1 пациента на 1-м месяце терапии отметили обострение хронического геморроя. Тошнота и снижение аппетита обусловили уменьшение (на 2-4 кг) массы тела у 2 больных. Однако, начиная со 2-го месяца лечения, в значительном проценте случаев (2-й месяц лечения - 7,1, 3-й - 32,1, 4-й - 21,4) регистрировали увеличение массы тела на 3-5 кг, а у отдельных больных до 8 кг. Повышение массы тела, вероятно, обусловлено регулярным питанием пациентов и употреблением ими в пищу высококалорийных продуктов с большим содержанием белков и жиров, что является необходимым условием при терапии препаратом "Инвираза". Среди показателей периферической крови и биохимического анализа крови не отмечено существенных колебаний. Повышение свободной фракции билирубина более 1,5 верхней границы нормы (более 30 мкмоль/л) регистрировали у 3,6- 6,3% пациентов, повышение уровней АсАТ и АлАТ более 2,5 верхней границы нормы (100 МЕ/л) - у 3,1-17,9% пациентов, повышение уровней амилазы и ЩФ более 1,1 верхней границы нормы (242 и 264 МЕ/л соответственно) - у 3,6-7,1% больных. Повышения концентрации креатинина, снижения содержания глюкозы крови не наблюдали. Изменения биохимических параметров не сопровождались какими-либо клиническими проявлениями и не требовали медикаментозной коррекции. Лейкопения (менее З,0-109/л) и нейтропения (менее 1,5- 109/л) имели место у 3,6-10,7% больных на 1-3-м месяце лечения. К концу терапевтического курса эти показатели были в пределах значений здоровых лиц. Развития анемии (содержание гемоглобина менее 95 г/л) не наблюдали. У 1 пациента на 2-м месяце лечения зарегистрирована выраженная тромбоцитопения (24*109/л), которая была обусловлена особенностями течения ВИЧ-инфекции у данного больного (в крови обнаружен повышенный уровень антитромбоцитарных антител). Без проведения специфической терапии количество тромбоцитов через 1 мес увеличилось до 162*109 /л, а к концу исследования было равно 263,4* 109 /л. Выводы 1. Доказана эффективность комбинированной антиретровирусной терапии препаратами "Тимазид", "Хивид" и "Инвираза". У пациентов не отмечено клинических признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции. Концентрация РНК ВИЧ в плазме снизилась в 20 раз (медиана) через 1 мес лечения и оставалась в 11 раз ниже исходной через 4 мес терапии. Максимальный прирост количества С04-лимфоцитов (120 клеток в 1 мкл, медиана) наблюдали к 3-му месяцу лечения. 2. Переносимость комбинированной противоретровирусной терапии была хорошей. Ни у одного пациента лечение не было прекращено в связи с развитием нежелательных явлений, обусловленных проводимой терапией. Не зарегистрировано случаев тяжелых нежелательных явлений, связанных с комбинированной противоретровирусной терапией, потребовавших отмены, снижения дозы препаратов или проведения корригирующей терапии. ЛИТЕРАТУРА 1. Галегов Г. А. // Вопр. вирусол. - 1997. - № 6. - С. 284-286. 2. Carpenter С. С. J., Fischi M. A., Hammer S. M. et al. // J. A. M. A. - 1997. - Vol. 277. - P. 1962-1969. 3. Collier А. С., Coombs R. W., Schoenfeld D. A. et al. // New Engi. J. Med. - 1996. - Vol. 334. - P. 1011-1017. 4. Moyle С. II Exp. Opin. Invest. Drugs. - 1996. - Vol. 5. - P. 155-167. 5. Stellbrink H-J. // European Conference on Clinical Aspects and Treatment of HIV Infection, 6. - Hamburg, 1997. - Ab-str. 212. 6. Vella S., Lassarin A.. Carosi G. et al. // Antiviral Ther. - 1996. -Vol. 1. - P. 129-140. Поступила 26.05.98 Библиография БИБЛИОГРАФИЯ . Нормативные документы Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Разработаны: Центральный НИИ Эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора. Исполнители: Покровский В.В. Федоров Н.Л. Шипулин Г.А. Безруков В.М. Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасовича Госкомсанэпиднадзора. Исполнители: Бектимиров Т.А. Блоха В.В. Российским научно-исследовательский противочумный институт Госкомсанэпиднадзора. Исполнитель: Куличенко А.Н. Бруцеллез ИДЕНТИФИКАЦИЯ БРУЦЕЛЛ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР). К. В. ШУМИЛОВ, О. Д. СКЛЯРОВ, И. Л. ОБУХОВ, К. Н. ГРУЗДЕВ, Г. А. ШИПУЛИН, О. Ю. ШИПУЛИНА ВГНКИ, ЦНИИЭ Ветеринария, 1996, № 12, стр. 19-23 . Вирусный гепатит В Информативность различных маркеров гепатита B. Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Чуланов В.П., Алленов М.Н. ММА им.Сеченова, Москва МАТЕРИАЛЫ VII СЪЕЗДА ВСЕРОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА. ЭПИДЕМИОЛОГОВ, МИКРОБИОЛОГОВ И ПАРАЗИТОЛОГОВ Всероссийское общество эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Министерство здравоохранения Российской Федерации Российская академия медицинских наук. ТОМ N2, Москва 28-31 января, 1997 . Вирусный гепатит С Использование полимеразной цепной реакции в обнаружении вируса гепатита С. Н.А. Федоров, В.П. Чуланов, Е.В. Волчкова, А.Х. Асаци мобархан, О.К.Шеремет Лаборатория ПЦР-генодиагностики Центрального НИИ эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ, кафедра инфекционных болезней медико-профилактического факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, НПО "Авиценна", Москва) Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Российская Академия медицинских наук. N 4 том 3 1995 . ХРОНИЧЕСКИЙ ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ В и С У ДЕТЕЙ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ: РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНТРОНОМ А О.Г. Желудкова, M.Г. Русанова, Т.А. Ишкова, И.О. Лазарева, О.Ю. Шипулина, НИИ детской гематологии МЗ и РФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ и РФ, санаторий "Русское поле" ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ. Достижения и перспективы. Информационный бюллетень № 2(3), 1998. Вирусный гепатит G Частота обнаружения РНК вируса гепатита G (HGV) у наркоманов, больных вирусными гепатитами. В.П. Чуланов, Г.А. Шипулин, О.Ю. Шипулина, С.Л. Максимов, Е.В. Волчкова Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, кафедра инфекционных болезней МПФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Московская клиническая инфекционная больница N2. Хламидиоз ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВ ХЛАМИДИЙ. И.Л.Обухов, Г.А.Шипулин, К.Н.Груздев, член-корреспондент Россельхозакадемии А.Н.Панин . МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД В ДИАГНОСТИКЕ ХЛАМИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ИЛ. ОБУХОВ, Г.А. ШИПУЛИН, К.Н. ГРУЗДЕВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ. 1996. ?4 . Бактериальные менингиты Heterozygous C8/3 complement deficiency does not predispose to meningococcal disease. A. E. PLATONOV, G. A. SHIPULIN, 0. JU. SHIPULINA, I. V. VERSHININA & P. DENSEN Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia, and *Department of Internal Medicine, The University of Iowa, Iowa City, 1A, USA . PCR-BASED ASSAY FOR CONFIRMATION AND IDENTIFICATION OF SEROGROUP A, B AND С MENINGOCOCCAL DISEASE. Shipulin G.A.,2 Tyntyunnik E.N., Shipulшa O.J., Koroleva I.S., Vengerov JuJa, PlatonovA.E. Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia; Moscow Institute of Medicine and Dentistry, Russia. Meningococcal disease and polymorphism of Fc7RIIa (CD32) in late complement component-deficient individuals. A. E. PLATONOV, E. J. KUIJPER*, I. V. VERSHININA, G. A. SH1PULIN, N. WESTERDAAL^, C. A. P. FIJEN* & J. G. J. VAN DE WINKEL Central Institute of Epidemiology, Moscow, Russia, *Department of Medical Microbiology, WHO Reference Laboratory for Bacterial Meningitis, The University of Amsterdam and Academic Medical Centre, Amsterdam, ^Department of Immunology and ^^Medarex Europe, University Hospital Utrecht, Utrecht, The Netherlands. ВИЧ-ИНФЕКЦИЯ ВИРУСНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНА ЗРЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ. (c) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК616.98:578.828.6]-06:617.7-022.6]-07 Н. Р. Марченко, В. И. Шахгилъдян, О. Ю. Шипулина, А. В. Кравченко НИИ глазных болезней РАМН; Российский научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом, Москва ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, N5, 1998 . ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ- ИНФЕКЦИИ. К.А. Саркисян, Г.А. Шипулин, М.С. Воробьева, О.Ю. Шипулина, В.И. Шахгильдян, Л.В. Серебровская, В.В. Покровский. ГИСК им. Л.А. Тарасовича МЗ РФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва. ТИМАЗИД В СОЧЕТАНИИ С ХИВИДОМ И ИНВИРАЗОЙ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ С ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ (c) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК 615.281.8.03:616.98:578.828.6].036 А. В. Кравченко, Л. В. Серебровская, Е. Л. Голохвастова, Г. А. Шипулин, Е. В. Богословская, Э. С. Горбачева ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва. МЕСТО ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ. (c) КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1998 УДК 616.98:578.828.6]-078.33 Г. А. Шипулин К. А. Саркисян, Е. В. Богословская, О. Ю. Шипулина, М. С. Воробьева Российский научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом, Москва. Цитомегаловирусная инфекция Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. (c) КОЛЛЕКТИВ ABTOРOВ, 1998 УДК 616.98:578.828.6]-06:616.98:578.825.121-078 О. Ю. Шипулина, В. И. Шахгильдян, Г. А. Шипулин, А.В. Кравченко, Л.В. Серебровская, В. В. Покровский Центральный НИИ эпидемиологии Минздрава РФ, Российский центр профилактики и борьбы со СПИДом Минздрава РФ, Москва Вопросы вирусологии, 1998, №2, стр. 91-95 Страница обновлена 27 августа 1999 г. 10:21:00 СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ СИСТЕМА ОБРАБОТКИ ИЗОБРАЖЕНИЙ "BIOTEST" СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ СИСТЕМА ОБРАБОТКИ ИЗОБРАЖЕНИЙ "BIOTEST" Вы можете скачать демо-версию setup.zip Общие сведения. Система обработки изображений "BIOTEST" предназначена для ввода черно-белых изображений из видеокамеры в компьютер, их последующей обработке и записи всех результатов в общую базу данных. Система ориентирована на работу для ПЦР-анализа, но может использоваться и для других целей. Аппаратная часть может использоваться с любым трансиллюминатором с ультрафиолетовой подсветкой. Программное обеспечение рассчитано на работу только в системе Microsoft Windows (R) 95/98. Минимальные требования к компьютеру: - любая конфигурация, где устойчиво работает операционная система; - видеокарта с палитрой больше, чем 256 цветов. Аппаратная часть. В состав системы входит черно-белая видеокамера на ПЗС-матрицеPZS, объектив, светофильтр, видеоконтроллер и кабель. При этом видеокамера не требует дополнительного источника питания. Основные технические характеристики Видеокамера 1. Чувствительный элемент 1/2" ПЗС-матрицаPZS 2. Количество рабочих элементов 741 Х 576 3. Время накопления сигнала на ПЗС-матрицеPZS 3 минуты 4. Чувствительность при светосиле объектива F1.2 0.25 Lux 5. Чувствительность при выдержке 4 сек. 10e- 3 Lux 6. Гамма-коррекцияGamma 0.45 или 1 7. Автоматическая регулировка усиления АРУARU от 4 до 32 db 8. Габариты без объектива 42 Х 48 Х 95 мм Видеокамера может работать в двух режимах. Обычный режим формирует изображение за 40 мс. Режим накопления позволяет многократно повысить чувствительность. Видеокамера, в зависимости от поставки, может быть оснащена объективом с постоянным фокусным расстоянием 12-16 мм, либо трансфокатором. Видеоконтроллер: 1. Размер изображения 512 Х 512 точек 2. Количество градации уровня серого 256 3. Время ввода одного кадра 40 мс 4. Аппаратный интерфейс ISA 8 бит. Видеоконтроллер устанавливается в свободный слот типа ISA любого IBM совместимого компьютера. С помощью видеоконтроллера происходит управление всеми режимами видеокамеры. Изображение в обычном режиме обновляется в памяти видеоконтроллера с периодом в 40 мс, а затем считывается в компьютер и интерпретируется на мониторе. В режиме накопления период обновления устанавливается пользователем. Особенности. Благодаря режиму накопления система позволяет получать изображения слабо освещенных объектов, а применение специального светофильтра снижает требования к используемому ультрафиолетовому трансиллюминатору Программная часть. Программная часть состоит из двух модулей: BIOTEST и PCRBASE. BIOTEST Программа имеет три режима. Режим работы с видеокамерой позволяет управлять всеми ее функциями, интерпретировать изображение на мониторе компьютера и запоминать его в следующих графических форматах: TIFF, JPG, BMP, TGA. Режим обработки изображений содержит все необходимые функции графического редактора: преобразование яркости и контрастности, гамма-коррекция, поворот изображения на любой угол, масштабирование, печать. Для исследовательских целей доступна функция получения линейного профиля любой части изображения в координатах светимости. Спецрежим предназначен для быстрой обработки участков изображения и занесения результатов в базу данных. При работе с электрофореграммой геля в полуавтоматическом режиме определяются координаты каждой пробы (светлое пятно), ее интегральная светимость и объем под поверхностью, который может интерпретироваться как характеристика массы вещества. Каждой пробе присваивается уникальное имя и ряд отдельных характеристик таких как инфекция, поставщик, пациент. Кроме того предусмотрен ряд мер, позволяющих автоматически определять положительную или отрицательную реакцию на соответствующую инфекцию при предварительном назначении эталонной пробы. PCRBASE Программа позволяет просматривать и редактировать базу данных в виде таблицы, элементами которой являются: файл изображения, дата и перечисленные выше характеристики проб. Кроме того возможно осуществлять выборки из всей базы по дате, по инфекции и т.д. Как сама база, так и таблица запроса может экспортироваться в текстовый файл, который доступен другим программам, например Excel или Access. Информация для контакта: Институт Эпидемиологии т. (495) 974-9641 т. (495) 304-2201 WWW http://www.pcr.ru Разработчик системы E-Mail kek@dataforce.net ЦМВ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ (c) КОЛЛЕКТИВ ABTOРOВ, 1998 УДК 616.98:578.828.6]-06:616.98:578.825.121-078 О. Ю. Шипулина, В. И. Шахгильдян, Г. А. Шипулин, А.В. Кравченко, Л.В. Серебровская, В. В. Покровский Центральный НИИ эпидемиологии Минздрава РФ, Российский центр профилактики и борьбы со СПИДом Минздрава РФ, Москва Вопросы вирусологии, 1998, ¦2, стр. 91-95 Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) ? одно из самых частых и тяжелых оппортунистических заболеваний у людей с глубокими поражениями иммунной системы, которое нередко приводит к летальному исходу. По мнению отечественных и зарубежных исследователей, манифестная ЦМВИ развивается у 30?50% пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии IIIв (СПИД), поражая органы зрения, желудочно-кишечный тракт, центральную и периферическую нервные системы, являясь непосредственной причиной смерти 20? 30% больных (2, 4). Вместе с тем доказать этиологическую роль цитомегаловируса (ЦМВ) в развитии тех или иных клинических синдромов при ВИЧ-инфекции без лабораторного подтверждения невозможно, так как клинические проявления ЦМВИ не строго специфичны (12). Среди существующих лабораторных методов диагностики ЦМВИ у пациентов с ВИЧ-инфекцией наибольшие надежды связывают с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), которая позволяет не только выявлять ЦМВ в биологических жидкостях и тканях, но и определять его количество, что дает возможность следить за изменением вирусной нагрузки в процессе болезни и при проведении специфической противовирусной терапии (5, 7). Однако в настоящее время не существует коммерческой ПЦР-тест-системы для выявления ЦМВ и определения его концентрации в клиническом материале, и каждая группа исследователей использует собственный протокол, часто сложный для воспроизведения, требующий дорогого и не всегда доступного оборудования и реактивов (6, 9).Цель представленной работы заключалась в разработке простого и стандартного способа выявления ЦМВ и определения его количества в клетках крови с помощью ПЦР, оценке разработанного метода в диагностике активной ЦМВИ и слежении за эффективностью лечения у ВИЧ-инфицированных пациентов. Материалы и методы Подготовка проб крови. Кровь брали из вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА, отделяли лейкоциты, подсчитывали их концентрацию в камере Горяева и готовили грубый лизат но Е. Kawasaki (8) из 106 клеток в 100 мкл лизирующего буфера. Эффективность методики выделения ДНК оценивали с помощью ПЦР, добавляя в пробу контрольную ДНК в процессе лизиса клеток в концентрации 1000 геномов/мл. Амплификацчя участка ДНК ЦМВ с помощью ПЦР. Праймеры выбрали в консервативной области 4-го экзона гена MIE 1, их специфичность была подтверждена путем поиска гомологии в базах данных о нуклеотидцых последовательностях с помощью программы FASTA, а также при проведении ПЦР с ДНК герпесвирусов I, II, VI типов, вируса ветряной оспы, герпеса зостер, вируса Эпштейна?Барр. Последовательности праймеров: прямой: 5 -cca-agc-ggc-ctc-tga-taa-cca-agc; обратный: 5'-act-ggt-cag-cct-tgc-ttc-tag-tca-cc. В качестве положительного контроля использовали ДНК ЦМВ ("Sigma", США) в количестве 10 геномов (1000 геномов/мл). Концентрацию геномов ЦМВ определяли с помощью nested-PCR (дополнительная амплификация с внутренними праймерами) по методике (10). В качестве отрицательного контроля использовали ДНК из плаценты человека ("Serva", США) в количестве 2 мкг (200 мкг/мл). Реакцию проводили в термоциклерах отечественного производства (фирмы "ДНК-технология") в реакционном буфере следующего состава: 67 мМ трис-HCl рН 8,4, 16 мМ сульфата аммония, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 2,5 мМ сульфата магния, 0,125 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 15 пмоль каждого праимера, 2,5 ед. Tag-полимеразы. В реакцию брали 10 мкл подготовленного лизата клеток или его разведений. Проводили 45 циклов ПЦР при следующих температурных режимах: 95¦С ? 1 мин, 67¦С ? 1 мин, 72¦С ? 1 мин ? 10 циклов, 95¦С ? 30 с, 65¦С ? 30 с, 72¦С ? 30 с ? 35 циклов с обязательным использованием техники "горячего старта" (31). Детекция продуктов ПЦР. Продукты ПЦР анализировали электрофоретическим разделением в 1,75?2% агарозном геле, содержащем краситель (бромид этидия) в концентрации 1 мкг/мл используя трис-боратный электрофорезный буфер. Детекцию продуктов ПЦР проводили в отдельном помещении, согласно рекомендуемым правилам работы в ПЦР-лаборатории (1). После проведения электрофоретического разделения ДНК (длина пробега бромфенолового синего составляла 4?5 см) гель просматривали в ультрафиолетовом свете, используя трансиллюминатор "Флускоп", и фотографировали на пленку "Микрат 300". Длина амплифицированного продукта составляла 500 пар нуклеотидов. Определение титра ДНК ЦМВ. Готовили 4 10-кратных разведения исходного лизата, содержащего ДНК из 106 лейкоцитов в 100 мкл. Для разделения использовали лизирующий буфер. Проводили реакцию амплификации с каждым разведением, включая исходный лизат. Наличие ПЦР-сигнала только в исходной пробе соответствовало титру 1 : 1 (или 1+), в исходной пробе и 1-м разведении ? 1 : 10 (или 2+), в 2 разведениях ? 1 : 100 (или 3+), в 3 ? 1 : 1000 (или 4+), наличие специфической полосы во всех 4 разведениях соответствовало титру 1 : 10 000 (или 5+). Пациенты. С января 1994 г. по ноябрь 1996 г. исследовали 400 проб крови от 178 ВИЧ-инфицированных пациентов в возрасте 20?53 лет. У всех пациентов определяли содержание СD4-лимфоцитов с помощью моноклональных антител ("Becton Dickinson Immunocytometry Systems", США) методом проточной цитометрии. У 21 больного диагностирована манифестная ЦМВИ в виде ретинита, энтероколита, интерстициальной пневмонии, энцефалита, миелита, полиневрита (у большинства больных имело место сочетание 2 клинических форм ЦМВИ и более). В 18 случаях заболевание закончилось летальным исходом, в 16 из них диагноз болезни был подтвержден обнаружением цитомегалоклеток при гистологическом исследовании аутопсийного материала. Группу сравнения (18 человек) составили пациенты, умершие в течение периода наблюдения, не имевшие при жизни вышеперечисленных признаков манифестной ЦМВИ. При гистологическом исследовании аутопсийного материала пациентов этой группы цитомегалоклетки не были обнаружены ни в одном случае. 9 пациентов с манифестной ЦМВИ (в том числе 7 с ЦМВ-ретинитом) получали противоцитоме-галовирусную терапию: ганцикловир (5 человек) и фоскарнет (4 человека). Лечебный и поддерживающий курсы продолжали по 2 нед. До начала лечения и в конце лечебного курса у пациентов с ретинитом проводили офтальмологический осмотр и определяли титр ДНК ЦМВ. Также исследовали 100 образцов крови здоровых лиц, не имеющих антител к ВИЧ, в возрасте 20?59 лет. Статистический анализ выполняли с помощью программы SPSS. Результаты и обсуждение На рис. 1 представлен пример тестирования в модельных условиях предлагаемой нами методики, которая позволяла в 100% постановок обнаруживать 10 копий ДНК ЦМВ (1000 геномов/мл) при фоновой нагрузке очищенной геномной ДНК человека в концентрации 0,2 мг/мл и при добавлении к суспензии лейкоцитов крови доноров (107 клеток/мл) в процессе подготовки пробы к ПЦР. Неспецифической амплификации геномной ДНК человека, взятой в реакцию в количестве 1, 2 и 5 мкг, не наблюдали. Отрицательный контроль ни разу не дал положительной реакции (т. е. контаминация в процессе работы отсутствовала), что мы связываем прежде всего с правильной организацией ПЦР-лаборатории (1). Рис 1. В группе здоровых доноров ДНК ЦМВ в 105 лейкоцитов периферической крови не обнаружена ни в одном случае, что согласуется с данными других авторов (11), тогда как у ВИЧ-инфицированных лиц частота обнаружения ДНК ЦМВ составила 38,3%. Результаты определения наличия ДНК ЦМВ и ее титра у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции (классификация В. И. Покровского, 1989 г.) и концентрацией СD4-клеток в крови представлены в табл. 1 и 2. По мере прогрессирования ВИЧ-инфекции и снижения количества СD4-клеток в периферической крови возрастали процент положительных проб и титр ДНК ЦМВ. При оценке клинического значения различных титров ДНК ЦМВ в крови получены следующие результаты. На момент 1-го обследования (данные в табл. 1 и 2 не приводятся) высокий титр ДНК ЦМВ (1:1000 и более) определен у 13 пациентов, 10 (77%) из них уже имели манифестную ЦМВИ, подтвержденную впоследствии обнаружением ЦМВ в аутопсийном материале у 9 (69%). У остальных 3 (23%) больных этой группы не выявлено какой-либо выраженной органной патологии, но при этом у них были отмечены повышение температуры тела (до 38?40¦С), резкая слабость, значительное снижение массы тела. При дальнейшем наблюдении у этих пациентов через 1?2 мес. развились ретинит, колит и пневмония ЦМВ-этиологии. Ни у одного из 19 пациентов с титром 1 : 100 (3+) манифестная ЦМВИ на момент обследования не была выявлена. В то же время у 16 (84%) больных данной группы были зафиксированы длительная (более 14 дней) субфебрильная лихорадка, умеренное (на 10?15%) снижение массы тела, анорексия, слабость; у 11 (57,8%) пациентов титр ДНК ЦМВ в дальнейшем возрос до 1 : 1000 (4+), при этом регистрировали повышение температуры тела (выше 38,5¦С), усиление слабости, дальнейшее снижение массы тела. У 8 (42%) пациентов через 1?6 мес. (в среднем 3,8 мес. с момента выявления ДНК ЦМВ в титре 1 : 100) развилась манифестная ЦМВИ. У пациентов с более низкими титрами ДНК ЦМВ: 1 : 10 (9 человек, среднее время наблюдения 8,7 мес.) и 1 : 1 (33 человека, среднее время наблюдения 17,5 мес.) хориоретинит и другие формы манифестной ЦМВИ не развились. У 2 (11,1%) из 18 пациентов группы сравнения ДНК ЦМВ не обнаружена, у 9 (50%) выявлена в титре 1+, у 7 (38,9%) ? в титре 2+, причем у 3 из последних титр повысился до 3+ (1 человек) и 4+ (2 человека) за 1?2 нед. до смерти. Полученные результаты показывают, что наличие ДНК ЦМВ в крови ВИЧ-инфицированных больных в титрах 4+ и 5+ может служить диагностическим маркером манифестной ЦМВИ и являться показанием к назначению специфической противовирусной терапии. При проведении терапии ганцикловиром (5?10 мг/кг 2 раза в сутки внутривенно) или фоскарнетом (60 мг/кг 3 раза в сутки внутривенно) у 8 (88,8%) больных титр ДНК ЦМВ снизился в 100 раз и более (рис. 2), причем у 4 пациентов ДНК ЦМВ в клетках не определялась. У 1 пациента титр ДНК ЦМВ снизился только в 10 раз (до 4+). Параллельно у всех пациентов наблюдали значительную положительную динамику клинической симптоматики. После окончания поддерживающей терапии при отсутствии вторичной профилактики манифестной ЦМВИ в среднем через 59 дней (при лечении ганцикловиром) и 45 дней (при лечении фоскарнетом) концентрация ДНК ЦМВ вновь возрастала, достигая уровня 4+ (рис. 3), что сопровождалось возникновением рецидива заболевания. Рис. 2 Рис. 3 Таким образом, для разработанной на основе ПЦР стандартной методики выявления и количественного определения ДНК ЦМВ в клетках установлено клиническое значение различных титров ДНК ЦМВ в лейкоцитах ВИЧ-инфицированных больных. Данная методика является недорогим, быстрым и стандартизованным методом оценки эффективности специфической противовирусной терапии у ВИЧ-инфицированных больных с манифестной ЦМВИ. ЛИТЕРАТУРА 1. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения / Покровскип В. В., Федоров Н. А., Шипулин Г. А. и др. ? М., 1995. 2. Шахгильдян В. И., Кравченко А. В.. Шипулина О. Ю. и др. Диагностика и клиническая характеристика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных лиц // Тер. арх. - 1996. - ¦ 4. - С. 65-68. 3. Chou Q., Russel М., Birch D. E. et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerisation improves low-copy-number amplification // Nucl. Acids Res. ? 1992. ? Vol. 20. - P. 1717-1723. 4. Drew W. L., Bushles W., Erlich K. S. Management of herpes virus infections (CMV, HSV, VZV) // The Medical Management of AIDS. ? Philadelphia, 1992. ? P. 359?383. 5. Drouet E., Boibeux A., Michelson S. Polymerase chain reaction detection of cytomegalovirus DNA in peripheral blood leukocytes as a predictor of cytomegalovirus disease in HIV-infected patients // AIDS. ? 1993. ? Vol. 7. - P. 665?668. 6. Fox J. C., Griffiths P. D, Emery V. C. Quantification of human cytomegalovirus DNA using the polymerase chain reaction // J. gen. Virol. - 1992. - Vol. 73. - P. 2405-2408. 7. Gerna G., Baldanti F., Zella D. et al. Detection of human cytomegalovirus DNA: How, when and where? // Scand. J. Infect. Dis. - 1995 - Vol. 99. Suppl. - P. 11-15. 8. Kawasaki E. S. Sample preparation from blood, cells and other fluids // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications / Eds М. A. Innis, D. Н. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. While. - San Diego, 1990. - P. 146-152. 9. Schafer P., Braun R. W., Mohring K. et al. Quantitative determination of human cytomegalovirus target sequences in peripheral blood leukocytes by nested polymerase chain reaction and temperature gel electrophoresis // J. gen. Virol, ? 1993. ? Vol. 74. ? P. 2699-2707. 10. Simmonds P., Balfe P., Peutherer J. et al. Human Immunodeficiency Virus-Infected Numbers Peripheral Mononuclear Cells and Low Copy Numbers // J. Virol. - 1990. ? Vol. 64. ? P. 864-872. 11. Urishibara N., Kwon K.-N., Takahashi T. A. et al. Human Cytomegalovirus DNA Is Not Detectable with Nested Double Polymerase Chain Reaction in Healthy Blood Donors // Vox Sang. - 1995. - Vol. 68. - P. 9-14. 12. Zurio S. S., O'Neill R. M., Polis М. A. et al. Lack of Clinical Utility of Cytomegalovirus Blood and Urine Cultures in Patients with HIV Infection // Ann. intern. Med. ? 1993. ? Vol. 118, N 1. - P. 12-17. Поступила 18.04.97 Информация зарегистрирована Информация зарегистрирована! Прейскурант на лабораторную диагностику. ПРЕЙСКУРАНТ Раздел ПРЕЙСКУРАНТ содержит информацию о ценах на диагностические услуги, которые оказывает Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ. ПРИЕМ ВРАЧЕЙ-СПЕЦИАЛИСТОВ (первичный) 1 Врач инфекционист (дерматолог, венеролог, гепатолог) 200,00р. 2 Врач инфекционист, кандидат наук (дерматолог, венеролог, гепатолог) 250,00р. 3 Врач инфекционист, доктор наук (по предварительной записи) 400,00р. 4 Врач инфекционист, член корреспондент РАМН (по предварительной записи) 550,00р. ПРИЕМ ВРАЧЕЙ-СПЕЦИАЛИСТОВ (повторный) 1 Врач инфекционист (дерматолог, венеролог, гепатолог) 150,00р. 2 Врач инфекционист, кандидат наук (дерматолог, венеролог, гепатолог) 200,00р. 3 Врач инфекционист, доктор наук (по предварительной записи) 250,00р. 4 Врач инфекционист, член корреспондент РАМН (по предварительной записи) 400,00р. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА 1 Взятие крови из вены 30,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Вирус гепатита A биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 2 Вирус гепатита B биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. кровь количественное исследование 425,00р. 3 Вирус гепатита C биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. кровь количественное исследование 850,00р. кровь генотипирование 350,00р. 4 Вирус гепатита D биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 5 Вирус гепатита G биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 6 Вирус ТТ биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 7 Цитомегаловирус соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. кровь количественное исследование 425,00р. 8 Вирус простого герпеса I и II типа соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 9 Вирус герпеса VI типа соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 10 Вирус Эпштейна-Барр соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 11 Вирус Варицелла - Зостер соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 12 Папиломавирус 16/18 соскоб, мазок, биоптат 80,00р. 13 Папиломавирус 31/33 соскоб, мазок, биоптат 80,00р. 14 Ротавирус кал, мазок 140,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Chlamydia trachomatis соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 2 Mycoplasma hominis соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 3 Mycoplasma genitalium соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 4 Mycoplasma species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 5 Ureaplasma urealiticum соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 6 Gardnerella vaginalis соскоб, мазок, моча 50,00р. 7 Trichomonas vaginalis соскоб, мазок, моча 50,00р. 8 Neisseria gonorrhoeae соскоб, мазок, моча 70,00р. 9 Neisseria species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 60,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 10 Haemophilus ducrei соскоб, мазок, моча 50,00р. 11 Haemophilus species кровь, биоптат, мокрота 70,00р. 12 Mycobacterium tuberculosis-bovis соскоб, мазок, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 80,00р. 13 Helicobacter pylori биоптат 100,00р. 14 Salmonella sp. кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 15 E. coli (энтеротоксигенные штаммы) - ST, LT кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 16 E. coli (энтерогеморрагические штаммы) кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 17 E. coli O157 H7 кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 18 Shigella + E. coli (энтероинвазивные штаммы) кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 19 Campylobacter jejuni соскоб, мазок, биоптат 100,00р. 20 Streptococcus species биоптат, синовиальная жидкость, мокрота 70,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 21 Brucella species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 90,00р. кровь качественный анализ 90,00р. 22 Listeria monocytogenes соскоб, моча, биоптат, спиномозг. ж-ть, мокрота 90,00р. кровь качественный анализ 90,00р. 23 Toxoplasma gondii спиномозг. ж-ть, соскоб, биоптат, кровь 70,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ГРИБКОВЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Candida albicans соскоб, мазок, моча, мокрота 50,00р. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Маркер Биологический материал Цена 1 HBsAg кровь 80,00р. 2 anti-HBsAb кровь 100,00р. 3 anti-HBcAb суммарные кровь 100,00р. 4 anti-HBcAb IgM кровь 100,00р. 5 HBeAg кровь 100,00р. 6 anti-HBeAb кровь 100,00р. 7 anti-DAb суммарные кровь 120,00р. 8 anti-DAb IgM кровь 120,00р. 9 anti-HCV суммарные кровь 100,00р. 10 anti-HCV IgM кровь 140,00р. 11 anti-HIV 1/2 кровь 150,00р. 12 Syphilis RPR кровь 60,00р. 13 Syphilis TPHA кровь 80,00р. 14 Syphilis TPHA (полуколичественный анализ) кровь 140,00р. 15 anti-HAV суммарные кровь 60,00р. 16 anti-HAV IgM кровь 120,00р. 17 anti-Toxo IgG кровь 60,00р. 18 anti-Toxo IgM кровь 120,00р. 19 anti-CMV IgG кровь 60.00р. 20 anti-CMV IgM кровь 120,00р. 21 anti-Rubella IgG кровь 60,00р. 22 anti-Rubella IgM кровь 120,00р. 23 anti-HSV суммарные кровь 60,00р. 24 anti-HSV IgM кровь 120,00р. 24 Chlamydia IgA кровь 100,00р. 25 Chlamydia IgA кровь 100,00р. ИММУНОЛОГИЯ Исследование Биологический материал Цена 1 CD3, CD4, CD8, CD16, CD20 кровь 300,00р. 2 Иммуноглобулины A, M, G кровь 90,00р. 3 ЦИК кровь 15,00р. 4 НСТ-тест кровь 26,00р. БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ Наименование теста Биологический материал Цена 1 Калий кровь (гепариновая плазма) 45,00р. 2 Натрий кровь (гепариновая плазма) 45,00р. 3 Кальций кровь (сыворотка) 35,00р. 4 Железо кровь (сыворотка) 40,00р. 5 Альбумин кровь (сыворотка) 35,00р. 6 Билирубин общий (TB) кровь (сыворотка) 35,00р. 7 Билирубин прямой (DB) кровь (сыворотка) 35,00р. 8 Общий белок кровь (сыворотка) 32,00р. 9 Креатинин кровь (сыворотка) 35,00р. 10 Мочевина кровь (сыворотка) 35,00р. 11 Глюкоза кровь (сыворотка) 35,00р. 12 Холестерин кровь (сыворотка) 35,00р. 13 Триглицериды кровь (сыворотка) 40,00р. 14 Щелочная фосфатаза (ALCP) кровь (сыворотка) 35,00р. 15 Аланин-аминотрансфераза (ALT, GPT) кровь (сыворотка) 35,00р. 16 Аспартат-аминотрансфераза (AST, GOT) кровь (сыворотка) 35,00р. 17 Гамма-глутаминтрансфераза (GGT) кровь (сыворотка) 40,00р. 18 Креатинкиназа (CK) кровь (сыворотка) 40,00р. 19 Лактатдегидрогеназа (LDH) кровь (сыворотка) 50,00р. 20 Альфа-амилаза кровь (сыворотка) 45,00р. 21 ОЖСС кровь (сыворотка) 60,00р. 22 Фосфор кровь (сыворотка) 35,00р. 23 Магний кровь (сыворотка) 40,00р. Прейскурант на лабораторную диагностику. ПРЕЙСКУРАНТ Раздел ПРЕЙСКУРАНТ содержит информацию о ценах на диагностические услуги, которые оказывает Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ. ПРИЕМ ВРАЧЕЙ-СПЕЦИАЛИСТОВ (первичный) 1 Врач инфекционист (дерматолог, венеролог, гепатолог) 200,00р. 2 Врач инфекционист, кандидат наук (дерматолог, венеролог, гепатолог) 250,00р. 3 Врач инфекционист, доктор наук (по предварительной записи) 400,00р. 4 Врач инфекционист, член корреспондент РАМН (по предварительной записи) 550,00р. ПРИЕМ ВРАЧЕЙ-СПЕЦИАЛИСТОВ (повторный) 1 Врач инфекционист (дерматолог, венеролог, гепатолог) 150,00р. 2 Врач инфекционист, кандидат наук (дерматолог, венеролог, гепатолог) 200,00р. 3 Врач инфекционист, доктор наук (по предварительной записи) 250,00р. 4 Врач инфекционист, член корреспондент РАМН (по предварительной записи) 400,00р. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА 1 Взятие крови из вены 30,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Вирус гепатита A биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 2 Вирус гепатита B биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. кровь количественное исследование 425,00р. 3 Вирус гепатита C биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. кровь количественное исследование 850,00р. кровь генотипирование 350,00р. 4 Вирус гепатита D биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 5 Вирус гепатита G биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 140,00р. кровь полуколичественный анализ 250,00р. 6 Вирус ТТ биоптат 140,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 7 Цитомегаловирус соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. кровь количественное исследование 425,00р. 8 Вирус простого герпеса I и II типа соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 9 Вирус герпеса VI типа соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 10 Вирус Эпштейна-Барр соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 11 Вирус Варицелла - Зостер соскоб, мазок, моча, мокрота, биоптат 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. кровь полуколичественный анализ 140,00р. 12 Папиломавирус 16/18 соскоб, мазок, биоптат 80,00р. 13 Папиломавирус 31/33 соскоб, мазок, биоптат 80,00р. 14 Ротавирус кал, мазок 140,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Chlamydia trachomatis соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 2 Mycoplasma hominis соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 3 Mycoplasma genitalium соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 4 Mycoplasma species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 5 Ureaplasma urealiticum соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 50,00р. 6 Gardnerella vaginalis соскоб, мазок, моча 50,00р. 7 Trichomonas vaginalis соскоб, мазок, моча 50,00р. 8 Neisseria gonorrhoeae соскоб, мазок, моча 70,00р. 9 Neisseria species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 60,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 10 Haemophilus ducrei соскоб, мазок, моча 50,00р. 11 Haemophilus species кровь, биоптат, мокрота 70,00р. 12 Mycobacterium tuberculosis-bovis соскоб, мазок, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 80,00р. 13 Helicobacter pylori биоптат 100,00р. 14 Salmonella sp. кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 15 E. coli (энтеротоксигенные штаммы) - ST, LT кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 16 E. coli (энтерогеморрагические штаммы) кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 17 E. coli O157 H7 кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 18 Shigella + E. coli (энтероинвазивные штаммы) кал, соскоб, мазок, биоптат 70,00р. 19 Campylobacter jejuni соскоб, мазок, биоптат 100,00р. 20 Streptococcus species биоптат, синовиальная жидкость, мокрота 70,00р. кровь качественный анализ 70,00р. 21 Brucella species соскоб, мазок, моча, биоптат, синов. ж-ть, мокрота 90,00р. кровь качественный анализ 90,00р. 22 Listeria monocytogenes соскоб, моча, биоптат, спиномозг. ж-ть, мокрота 90,00р. кровь качественный анализ 90,00р. 23 Toxoplasma gondii спиномозг. ж-ть, соскоб, биоптат, кровь 70,00р. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ГРИБКОВЫЕ ИНФЕКЦИИ Возбудитель Биологический материал Цена 1 Candida albicans соскоб, мазок, моча, мокрота 50,00р. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Маркер Биологический материал Цена 1 HBsAg кровь 80,00р. 2 anti-HBsAb кровь 100,00р. 3 anti-HBcAb суммарные кровь 100,00р. 4 anti-HBcAb IgM кровь 100,00р. 5 HBeAg кровь 100,00р. 6 anti-HBeAb кровь 100,00р. 7 anti-DAb суммарные кровь 120,00р. 8 anti-DAb IgM кровь 120,00р. 9 anti-HCV суммарные кровь 100,00р. 10 anti-HCV IgM кровь 140,00р. 11 anti-HIV 1/2 кровь 150,00р. 12 Syphilis RPR кровь 60,00р. 13 Syphilis TPHA кровь 80,00р. 14 Syphilis TPHA (полуколичественный анализ) кровь 140,00р. 15 anti-HAV суммарные кровь 60,00р. 16 anti-HAV IgM кровь 120,00р. 17 anti-Toxo IgG кровь 60,00р. 18 anti-Toxo IgM кровь 120,00р. 19 anti-CMV IgG кровь 60.00р. 20 anti-CMV IgM кровь 120,00р. 21 anti-Rubella IgG кровь 60,00р. 22 anti-Rubella IgM кровь 120,00р. 23 anti-HSV суммарные кровь 60,00р. 24 anti-HSV IgM кровь 120,00р. 24 Chlamydia IgA кровь 100,00р. 25 Chlamydia IgA кровь 100,00р. ИММУНОЛОГИЯ Исследование Биологический материал Цена 1 CD3, CD4, CD8, CD16, CD20 кровь 300,00р. 2 Иммуноглобулины A, M, G кровь 90,00р. 3 ЦИК кровь 15,00р. 4 НСТ-тест кровь 26,00р. БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ Наименование теста Биологический материал Цена 1 Калий кровь (гепариновая плазма) 45,00р. 2 Натрий кровь (гепариновая плазма) 45,00р. 3 Кальций кровь (сыворотка) 35,00р. 4 Железо кровь (сыворотка) 40,00р. 5 Альбумин кровь (сыворотка) 35,00р. 6 Билирубин общий (TB) кровь (сыворотка) 35,00р. 7 Билирубин прямой (DB) кровь (сыворотка) 35,00р. 8 Общий белок кровь (сыворотка) 32,00р. 9 Креатинин кровь (сыворотка) 35,00р. 10 Мочевина кровь (сыворотка) 35,00р. 11 Глюкоза кровь (сыворотка) 35,00р. 12 Холестерин кровь (сыворотка) 35,00р. 13 Триглицериды кровь (сыворотка) 40,00р. 14 Щелочная фосфатаза (ALCP) кровь (сыворотка) 35,00р. 15 Аланин-аминотрансфераза (ALT, GPT) кровь (сыворотка) 35,00р. 16 Аспартат-аминотрансфераза (AST, GOT) кровь (сыворотка) 35,00р. 17 Гамма-глутаминтрансфераза (GGT) кровь (сыворотка) 40,00р. 18 Креатинкиназа (CK) кровь (сыворотка) 40,00р. 19 Лактатдегидрогеназа (LDH) кровь (сыворотка) 50,00р. 20 Альфа-амилаза кровь (сыворотка) 45,00р. 21 ОЖСС кровь (сыворотка) 60,00р. 22 Фосфор кровь (сыворотка) 35,00р. 23 Магний кровь (сыворотка) 40,00р. Словарь .СЛОВАРЬ Раздел СЛОВАРЬ содержит термины употребляемые в молекулярной микробиологии, бактериологии, вирусологии, диагностике и терапии инфекционных заболеваний . А Б В Г Д Е Ж З И К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я . А Антибиотики вещества природного происхождения, обладающие выраженной биологической активностью против микроорганизмов, которые могут быть получены из микробов, растений, животных тканей или методом химического синтеза. Антитела глобулярные белки, обладающие способностью специфически связываться с антигенами. Антигены вещества, которые воспринимаются организмом, как чужеродные и вызывают специфический иммунный ответ; способны взаимодействовать с продуктами этого ответа - антителами (иммуноглобулинами) и иммуноцитами как in vivo, так и in vitro. наверх Б Белки, протеины высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков аминокислот. наверх В Вирион вирусная частица, внеклеточная покоящаяся форма существования вируса. Вирусы неклеточные формы жизни, способные проникать в определенные живые клетки и размножаться только внутри этих клеток. Подобно всем другим организмам вирусы обладают собственным генетическим аппаратом, который кодирует синтез вирусных частиц из биохимических предшественников, находящихся в клетке-хозяине; при этом используются биосинтетические и энергетические системы этой клетки. Таким образом, вирусы являются внутриклеточными паразитами. наверх Г Ген наследственный фактор, функционально неделимая единица генетического материала; участок молекулы ДНК (у некоторых вирусов РНК), кодирующий первичную структуру полипептида, молекулы транспортной или рибосомальной РНК или взаимодествующий с регуляторным белком. Генотип совокупность генов данной клетки или организма составляет его генотип. наверх Д ДНК, Дезоксирибонуклеиновые кислоты нуклеиновые кислоты, которые содержат в качестве углеводного компонента дезоксирибозу, а в качестве азотистых оснований аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), тимин (Т). Присутствуют в клетках любого организма, а также входят в состав многих вирусов. наверх Е Единица биологическая доза биологически активного вещества, которую необходимо ввести определенному животному для получения объективного регистрируемого специфического биологического эффекта. Активность препаратов, подвергающихся биологической стандартизации, выражается в единицах действия (ЕД). Для ряда препаратов установлены международные единицы действия (МЕ). наверх Ж наверх З наверх И Избирательность анализа способность диагностикума выявлять возбудителя инфекционного заболевания конкретного вида на фоне других микроорганизмов, вирусов и клеток организма-хозяина. Иммунитет (от лат. immunitas - освобождение, избавление от чего-либо) невосприимчивость, резистентность, сопротивляемость, способность организма защищать собственную целостность и биологическую индивидуальность. Частное проявление Иммунитета - невосприимчивость к инфекционным заболеваниям. Иммуноглобулины см. Антитела Интерференция вирусов тип взаимодействия между вирусами, при котором наблюдается подавление репродукции одного вируса другим в клетках, смешанно зараженных двумя вирусами. Проявляется на разных стадиях вирусной инфекции и может быть обусловлена конкуренцией за клеточные рецепторы при адсорбции вируса на клеточной поверхности, за участки репликации нуклеиновой кислоты и трансляции, истощением метаболитов в клетке, индукцией интерферона и др. причинами. Интерференцию вирусов используют для обнаружения, идентификации и титрования нецитопатогенных вирусов. Интрон участок гена (ДНК) эукариот который, как правило, не несет генетической информации, относящейся к синтезу белка, кодируемого данным геном; расположен между другими фрагментами структурного гена - экзонами. наверх К наверх Л Локус местоположение определенного (его аллелей) на генетической или цитологической карте хромосомы. Лигазы класс ферментов, катализирующих реакции присоединения друг к другу двух различных молекул за счет энергии сопряженной реакции гидролиза нуклеозидтрифосфатов (чаще всего АТФ). В зависимости от характера образующей связи (C-O, C-S, C-N, и C-C - связи) Лигазы делят на подклассы. В качестве кофермента Лигаз участвует биотин. Широко распространены в природе и играют важную роль в биосинтезе белков, липидов и углеводов. наверх М Микрофлора открытый биоциноз микроорганизмов, встречающихся у здоровых макроорганизмов. У макроорганизмов микробы заселяют поверхность кожи, слизистых дыхательных и выделительных путей, пищеварительного тракта. Мобильные гены структурно и генетически дискретные фрагменты ДНК, способные перемещаться по геному клеток. Считается, что Мобильные гены кодируют белки, ответственные за их перемещение и репликацию. Мобильные гены вызывают множество наследственных изменений в клетках, являясь причиной инсерционного мутагенеза. Встраиваясь в различные участки хромосом, они инактивируют или усиливают экспрессию клеточных генов, вызывают различные хромосомные перестройки, т. е. вносят в геном факторы нестабильности и изменчивости, что, возможно, определяет их важную роль в эволюции. наверх Н Нуклеотиды нуклеозидфосфаты, фосфорные эфиры нуклеозидов. Состоят из азотистого основания (обычно пуринового или пиримидинового), углевода рибозы (рибонуклеотиды) или дезоксирибозы (дезоскирибонуклеотиды) и одного или нескольких остатков фосфорной кислоты. Надежность анализа защищенность анализа от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. наверх О Онкогены гены, обусловливающие превращение нормальных клеток эукариот в злокачественные. Действие Онкогенов реализуется посредством кодируемых ими онкобелков. Онкогены присутствуют в вирусах ДНК-содержащих и РНК-содержащих, а также в геноме опухолевых клеток наверх П Протеины простые белки, состоящие только из остатков аминокислот. К протеинам относятся только многие ферменты. Иногда термин "Протеины" употребляют как синоним всех белков. Протеиды сложные белки, содержащие небелковый компонент - простетическую группу. В зависимотси от химической природы последней Протеиды подразделяют на нуклеопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды и др. К Протеидам относятся многие ферменты. наверх Р РНК, Рибонуклеиновые кислоты нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента рибозу, а в качестве азотистых оснований - аденин, гуанин, урацил, цитозин, а также их модифицированные производные (например, метилированные). наверх С Секвенирование определение последовательности элементов, образующих полимер, например аминокислотных остатков в полипептидах или нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Серотип 1. Подтип в пределах данного вида бактерий, идентифицируемый серологическими методами, т. е. по поверхностным антигенам с помощью специфических антител. 2. Набор общих серологически определяемых детерминант O-антигена данного штамма сальмонелл или других энтеробактерий. наверх Т Трансдукция передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов. Трандукция специфическая способность фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту наверх У наверх Ф Фланкирующие последовательности последовательности нуклеотидов, пептидов и полисахаридных цепей, прилегающие к рассматриваемой. наверх Х Хламидии облигатные внутриклеточные паразиты; размножаются только в цитоплазме клеток позвоночных, проделывая в них цикл развития. наверх Ц Цитокины собирательное название для иммуномедиаторов: лимфокинов и монокинов (интерлейкинов, интерферонов, туморнекротизирующего фактора и т. д.) наверх Ч наверх Ш Штамм чистая культура микроорганизма, выделенного из определенного источника или полученного в результате мутаций. Разные штаммы одного и того же микроорганизиа могут различаться по ряду свойств, например, вирулентности чувствительности к антибиотикам и др. наверх Щ наверх Э Эпштейна-Барр вирус ДНК содержащий вирус человека. Относится к герпесвирусам. Возбудитель инфекционного мононуклеоза, лимфомы Беркитта и некоторых злокачественных опухолей носоглотки. Эпитоп Отдельная антигенная детерминанта наверх Ю наверх Я наверх Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция. КАК ОТКРЫЛИ ПЦР . НЕОБЫЧАЙНАЯ ИСТОРИЯ О ТОМ, КАК РОДИЛАСЬ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В мире науки (Scientific American) Июнь N 6 1990 г. Кэри Б. Мюллис лауреат Нобелевской премии в области химии Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах - ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии. Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной луной горной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь его называют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 млрд. сходных по структуре молекул. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За семь лет, прошедших с той апрельской ночи, ПЦР нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже 15 лет все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны. Полимеразная цепная реакция значительно облегчила работу молекулярных биологов - с ее помощью они могут получать сколь угодно большие количества специфической ДНК. На первый взгляд может показаться, что ДНК получить очень просто. В действительности выделить специфический тип молекул нативной ДНК из любого организма, за исключением чрезвычайно простых вирусов, - задача не из легких.. смотри рисунок N1 Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов: дезокиаденилатов (А), дезоксигуанилатов (G), дезокситимидилатов (Т) и дезоксицитидилатов (С). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой: а располагаются всегда против T, а G против С. Благодаря комплементарности цепи удерживаются вместе. У каждой цепи есть 3` конец и 5` конец. Поскольку ориентации двух цепей противоположны, говорят, что оно антипараллельны. Трудности обусловлены самой природой молекул ДНК. Они представляют собой хрупкие цепи, построенные из четырех типов дезоксирибонуклеотидов: дезоксиаденилата (А), дезокситимидилата (Т), дезоксигуанилата (G) и дезоксицитидилата (С); в последовательности этих оснований закодирована генетическая информация. Одиночные цепи ДНК встречаются редко, обычно пары цепей с комплементарными последовательностями образуют двойные спирали, в которых остатки А в одной цепи связываются с остатками Т в другой, а остатки G связываются с остатками С (см. рисунок нас. 27). В клетках молекулы ДНК окружены белками, которые обеспечивают ее более плотное свертывание. Как правило, не удается выделить ДНК из клеток неповрежденной - нить оказывается разорванной в случайно расположенных точках. Поэтому, если ДНК выделяется из 1000 идентичных клеток, препарат будет содержать 1000 копий каждого гена, однако все эти копии окажутся во фрагментах разной длины. В течение длительного времени эта проблема затрудняла изучение генов. Наконец, в 70-х годах были открыты ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом легче выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами. К концу 70-х годов молекулярные биологи энергично взялись за изучение ДНК с помощью эндонуклеаз и других молекул, называемых олигонуклеотидными пробами (зондами). Олигонуклеотид представляет собой короткую цепь нуклеотидов, расположенных в специфической последовательности. В определенных условиях олигонуклеотид специфически связывается с комплементарной последовательностью нуклеотидов в одноцепочечной ДНК. Поэтому искусственно синтезированные радиоактивные олигонуклеотиды могут служить "пробами", когда необходимо определить, содержит ли препарат ДНК специфическую последовательность нуклеотидов или ген. В 1979 г. я поступил на работу в фирму Cetus в Эмервилле (шт. Калифорния), в мои обязанности входил синтез олигону-клеотидных проб. К 1983 г. синтез олигонуклеотидов стал утрачивать свою привлекательность для химиков. Этот трудоемкий процесс - своего рода искусство - стала вытеснять более надежная технология с применением автоматических устройств. Это было огромным достижением. В результате этой минипромышленной революции у химиков, синтезирующих олигонуклеотиды, работы стало гораздо меньше. Автоматические синтезаторы, которые мы стали использовать, позволяли получать даже больше олигонуклеотидов, чем помещалось в холодильниках, и заведомо больше, чем могли использовать в своих опытах молекулярные биологи, которые, как оказалось, работали еще нерасторопнее, чем мы предполагали. У меня оказалось вполне достаточно свободного времени на размышления и я почти невольно стал придумывать различные комбинации с олигонуклеотидами. Я понимал, как важно разработать простой метод идентификации нуклеотида в заданном положении в молекуле ДНК, особенно для ДНК высокой сложности (например, ДНК человека), а также для малых количеств ДНК. Я не видел принципиальных препятствий, чтобы для этого использовать фермент ДНК-полимеразу и один из вариантов метода, который называют секвенированием с использованием дидезоксинуклеотидов. Для проверки этого предположения я задумал несложный эксперимент. Чтобы понять ход моих мыслей, стоит напомнить некоторые данные о ДНК. Концы цепи ДНК химически различны, один обозначается как 5', другой - как 3 '. В двойной спирали ДНК комплементарные цепи антипараллельны, следовательно, 3'-конец одной цепи связан с 5 '-концом другой, и наоборот. В 1955 г. А. Корнберг и его коллеги из Станфордского университета открыли в клетках фермент, который назвали ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы выполняют ряд функций, в том числе обеспечивают репарацию и репликацию ДНК. Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков). Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи. Например, если это А, полимераза присоединяет Т, если матричный нуклеотид - G, то фермент присоединяет С. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5 ' -конца матрицы (см. рисунок на с. 29). В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи. Остановимся теперь на методе секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов, который обычно называют методом Сэнгера, по имени одного из его создателей - Ф. Сэнгера из Лаборатории молекулярной биологии Британского совета медицинских исследований. Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК он использовал ДНК-полимеразу, матричную ДНК, нуклеозидтифосфаты, а также специальные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP). Подобно обычным нуклеотидам, ddNTP могут быть присоединены к концу растущей цепи с помощью ДНК-полимеразы, однако ddNTP при этом блокирует 3 ' -конец, полностью предотвращая дальнейшее наращивание цепи. В реакции Сэнгера можно получить праймеры, удлиненные в разной степени, а затем блокированные ddNTP, Зная, какой из ddNTP был присоединен, и определив длину синтезированных фрагментов ДНК, можно установить последовательность нуклеотидов в матричной цепи. Например, если в данном положении был присоединен дидезоксиаденозин (ddA), соответствующим комплементарным основанием в матрице должен быть Т, а присоединение дидезоксигуанозина (dclG) означает присутствие в матрице С. Я намеревался модифицировать этот метод и использовать только полимеразу, матрицу, ddNTP и праймер, т. е. исключить из смеси обычный нуклеозидтрифосфаты. Поэтому наращивание праймеров должно было завершиться сразу после включения первого же ddNTP в цепь. Если бы я знал, какой ddNTP присоединился к праймеру, можно было установить соответствующее основание в матричной цепи. Таким способом я смог бы идентифицировать основание в матричной цепи, располагающееся рядом с участком связывания праймера. смотри рисунок 2 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это простой лабораторный метод копирования фрагмента ДНК с использованием легко доступных реактивов. Поскольку число копий возрастает экспоненциально, всего за несколько часов можно получить более 100 млрд. копий. Тогда я не осознавал, что существуют довольно веские причины, по которым подобный метод определения последовательности нуклеотидов непригоден. Трудность заключалась в том, что иногда олигонуклеотиды гибридизуются не с теми последовательностями ДНК, для выявления которых они синтезированы; подобное неспецифическое связывание неизбежно привело бы к неоднозначности результатов. Даже наиболее искусным экспериментаторам не удавалось достичь связывания олигонуклеотидов с суммарной ДНК человека со специфичностью, которая позволяла бы получать осмысленные результаты.Именно из-за этих ограничений исследователи были вынуждены применять для изучения ДНК человека более сложные методы. Например, для разрезания ДНК могут быть использованы ферменты рестрикции, затем полученные фрагменты (рестрикты) можно разделить с помощью электрофореза. Таким способом добиваются некоторой "очистки" искомой последовательности ДНК от общей ДНК перед гибридизацией с олигонуклеотидными пробами. Благодаря этой процедуре уменьшается вероятность случайной гибридизации и соответственно увеличивается вероятность получения значимых результатов. Однако удается она далеко не всегда и, кроме того, занимает много времени и не позволяет работать с де-градированной или денатурированной ДНК. Другой подход, значительно более трудоемкий для рутинного анализа, основан на клонировании. Изучаемую последовательность нуклеотидов ДНК человека можно клонировать, или копировать, встроив ее в небольшую кольцевую ДНК, которая называется плазмидой. Затем, размножая бактериальные клетки, несущие эту плазмиду, можно получить большое количество исследуемой ДНК. Чтобы определить ее последовательность, проводят гибридизацию с олигонуклеотидом и секвенирование с использованием дидезоксинуклеотидов. С помощью такого подхода в начале 80-х годов была получена большая часть данных о последовательностях ДНК человека. Планируя свой довольно простой эксперимент, я не допускал и мысли о том, что для обнаружения специфической последовательности в ДНК человека с помощью гибридизации с олигонуклеотидом понадобится клонирование или какой-то другой этап. Чтобы оправдать свою наивность, замечу, что группа под руководством Г. Эрлиха, одного из ведущих специалистов фирмы Cetus, пыталась осуществить другой подход, также основанный на гибридизации одного олигонуклеотида со специфической последовательностью ДНК человека. Никто над нами не смеялся, более того, всем нам регулярно платили жалованье, и мы чувствовали себя на переднем крае генной инженерии. смотри рисунок N3 ДНК-ПОЛИМЕРАЗА - это фермент, способный наращивать короткие цепочки ДНК, так называемые олигонуклеотидные праймеры, если эти короткие цепочки связаны с более длинной "матричной" цепью ДНК. При этом полимераза присоединяет к 3'-концу связанного праймера соответствующий комплементарный нуклеотид. Однако если добавить дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например дидезоксиаденозин (ddA), дальнейший рост цепи будет невозможен, поскольку к 3'-концу ddA нуклеотиды присоединяться уже не могут. Однажды поздним вечером в пятницу вместе с подругой, также химиком из компании Cetus, я ехал в автомобиле в округ Мендоцино. Она спала. Шоссе 101 было пустынным. Я любил ночную езду и регулярно по выходным три часа проводил за рулем, чтобы попасть в свой загородный дом на севере Калифорнии. Руки при этом заняты, а голова свободна. Той ночью я думал о предстоящем эксперименте по секвенированию ДНК.У меня был прямой план. Прежде всего разделю цепи ДНК нагреванием, затем проведу гибридизацию олигонуклеотида с комплементарной последовательностью в одной из этих цепей. Эту смесь ДНК разделю на четыре пробирки. В каждой пробирке будут присутствовать все четыре типа ddNTP, но только один из них будет помечен радиоактивным изотопом. Затем добавлю ДНК-полимеразу, которая удлинит связанный с ДНК олигонуклеотид в каждой пробирке на один ddNTP. С помощью электрофореза можно отделить удлиненные олигонуклеотиды от оставшихся ddNTP. Определив, какой из радиоактивных ddNTP присоединился к олигонуклеотиду, можно будет установить, какой нуклеотид располагается в соответствующем положении в цепи ДНК. Очень просто. Вблизи Кловердейла, где шоссе Калифорния 128 уходит на север от шоссе 101 и начинается серпантин вверх по побережью, мне пришла мысль, что если вместо одного олигонуклеотида использовать два, такое определение будет гораздо точнее. Два праймера будут расположены с обеих сторон от пары нуклеотидов, которую я хотел идентифицировать. Если синтезировать олигонуклеотиды разного размера, их можно будет отличить друг от друга. Если олигонуклеотиды будут комплементарны разным цепям ДНК, можно будет определить соответствующие последовательности в обеих цепях молекулы. Это позволит без дополнительных сложностей осуществлять внутренний контроль. смотри рисунок N4 ЧТОБЫ ИДЕНТИФИЦИРОВАТЬ пару оснований в определенном положении фрагмента ДНК, автор статьи надеялся использовать вариацию метода секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов. Сначала два праймера должны были связаться с противоположными цепя праймеру мог присоединиться всего один нуклеотид. Идентифицировав присоединившиеся ddNTP, можно установить, какая пара нуклеотидов расположена между праймерами. Метод можно использовать с одним праймером, но применение двух праймеров обеспечивает контроль для подтверждения результатов. Планируя этот эксперимент, автор пришел к идее полимеразной цепной реакции. Хотя тогда я не отдавал себе в этом отчета, но задумав использовать два олигонуклеотида, расположенных по обе стороны от исследуемого гена, с 3'-концами, направленными друг к другу, я был очень близок к открытию ПЦР. В тот момент, однако, я был и на грани падения с горной дороги и остро ощущал это.Влажный ночной воздух был наполнен ароматом цветущих каштанов. Их белые "свечи" как бы выскакивали на меня в свете фар. Я думал о новых прудах, которые делал у себя на участке, а также о возможных осложнениях в планируемом опыте по секвенированию. Еще с тех пор, когда я стажировался в лаборатории В. Сэди в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, где Дж. Мейбаум разрабатывал для клиники метод определения нуклеотидов, я помнил, что препараты ДНК могут содержать следовые примеси нуклеозидтрифосфатов. Если эти случайные нуклеотиды будут присоединяться к 3'-концам праймеров до того, как произойдет присоединение меченых ddNTP, интерпретировать результаты электрофореза окажется непросто. Сначала я считал, что свободные нуклеозидтрифосфаты в пробе можно разрушить с помощью щелочной фосфатазы - бактериального фермента. Этот фермент отщепит от нуклеозидтрифосфатов необходимые для реакции остатки фосфата, предотвратив их участие в реакции полимеризации. Однако после этого придется каким то способом удалить фосфатазу из реакционной смеси, иначе она разрушит ddNTP, которые я добавлю. Обычно ферменты, активность которых нежелательна, можно инактивировать нагреванием пробы; при этом нарушается форма молекул фермента, важная для его функционирования действия. Однако я был уверен, что молекулы бактериальной щелочной фосфатазы после нагревания способны восстанавливать исходную форму и поэтому решил ее не использовать. Однако я ошибался. Значительно позже я узнал, что щелочную фосфатазу можно необратимо денатурировать, если полностью удалить из раствора ионы цинка и прогреть пробу. Как выяснилось, моя ошибка оказалась на редкость удачной: если бы я был лучше осведомлен, я перестал бы искать новые варианты эксперимента. Примерно каждую милю у меня рождалось новое решение, которое я тут же отбрасывал. Потом, когда начался спуск в долину Андерсона, пришла мысль применить один и тот же фермент - ДНК-полимеразу - дважды, сначала для того, чтобы удалить из пробы находящиеся в ней нуклеозидтрифосфаты, а затем, чтобы присоединить к праймеру меченые ddNTP. Я рассуждал так. Если в пробе присутствует достаточно нуклеотидов, чтобы исказить мой эксперимент, их должно быть также достаточно для функционирования ДНК-полимеразы. Если сначала провести своего рода имитацию реакции в присутствии олигонуклеотидных праймеров и ДНК-полимеразы, но без ddNTP, то можно без труда удалить свободные нуклеозидтрифосфаты, которые присоединятся к удлиняющимся олигонуклеотидам. Затем, повысив температуру реакционной смеси, я смогу отделить удлиненные олигонуклеотиды от матрицы ДНК. Однако при этом олигонуклеотиды с наращенными концами останутся в пробе, но таких праймеров будет намного меньше, чем исходных неудлиненных, поэтому, когда температура смеси снизится, с ДНК, вероятно, будут связываться преимущественно неудлиненные праймеры. Затем можно добавить ddNTP и новую порцию ДНК-полимеразы уже для проведения самого эксперимента по секвенированию. И все-таки некоторые вопросы продолжали беспокоить меня. Будут ли мешать реакции олигонуклеотиды, синтезированные в имитационной реакции? Что если они удлинятся не на один-два, а на большее число нуклеотидов и перекроют участок связывания второго праймера? Конечно, это приведет к осложнениям... Нет, отнюдь! Я вздрогнул от неожиданного прозрения: цепи ДНК в исходной матрице и в удлиненном олигонуклеотиде по последовательности нуклеотидов будут идентичны. В итоге в реакции имитации число ДНК-матриц для секвенирования удвоится! Неожиданно для меня аромат цветущих каштанов стал резко ослабевать. ЕСЛИ бы это было при обычных обстоятельствах, я бы не понял значения удвоения так быстро. Действительно, идея о многократном повторении одной и той же процедуры может показаться совсем скучной, однако я тратил массу времени на составление компьютерных программ и познакомился при этом с циклически повторяющимися "петлями" - процедурами, при которых одна и та же математическая операция многократно используется для преобразования результатов предыдущих циклов. Мой опыт подсказывал мне, что процессы экспоненциального роста в циклически повторяющихся операциях могут быть очень значительными. А вариант репликации ДНК, о котором я размышлял, представлял собой как раз такой процесс. Взволнованный, я стал перебирать в памяти степени числа 2: 2, 4, 8, 16, 32... Я помнил, что 2 в десятой степени составляет приблизительно 1000, а 2 в двадцатой степени - миллион. На выезде из долины Андерсона я остановил машину, достал бумагу и карандаш, чтобы проверить свои расчеты. Дженнифер, моя спящая пассажирка, слабо протестовала против задержки и против света в кабине, но я воскликнул, что открыл нечто фантастическое. В замешательстве она заснула снова. Я убедился в том, что 2 в двадцатой степени составляет несколько больше миллиона, и поехал дальше. Приблизительно через милю пути я понял еще кое-что о продуктах реакции. После нескольких циклов, состоящих из наращивания праймеров, отделения продуктов полимеризации, связывания новых праймеров и их наращивания, длина экспоненциально накапливающихся цепей ДНК окажется фиксированной, поскольку их концы будут точно определяться 5'-концами олигонуклеотидных праймеров. Если синтезировать праймеры, связывающиеся с более удаленными друг от друга участками ДНК, можно реплицировать в исходном препарате фрагменты ДНК большей длины. Продуктами реакции всегда будут фрагменты ДНК строго определенной длины. Я вновь остановил машину и принялся рисовать, как молекулы ДНК связываются друг с другом и удлиняются и как продукты одного цикла становятся матрицами для последующих циклов в цепной реакции... Дженнифер снова запротестовала сквозь сон. "Ты ни за что не поверишь, - крикнул я, - это невероятно!" Она не проснулась. Я поехал дальше, не останавливаясь до самого дома. В конце долины Андерсона начинаются секвойные леса. Существует давнее поверье, что в этих местах живут раззявы-неумехи. Я почувствовал, что своим открытием почти нарушил это представление. В ту ночь мне не спалось - в мозгу непрерывно взрывались дезоксирибонуклеиновые бомбы. Утром я был слишком изнурен и не мог поверить, что эту идею еще никто не реализовал. Тысячи ученых с разными целями производили наращивание олигонуклеотидов с использованием полимераз, и, конечно, кто-нибудь из них должен был заметить возможность полимеразной цепной реакции. Но если бы она кому-то удалась, я знал бы об этом: исследователи должны были бы использовать ее постоянно для амплификации, или размножения фрагментов ДНК. Вернувшись в понедельник в свою фирму, я обратился к Дж. Макгрегору, одному из библиотекарей, с просьбой провести компьютерный анализ литературы по ДНК-полимеразе. Он не обнаружил ничего, имеющего отношения к амплификации. На протяжении следующих нескольких недель я излагал свою идею любому желающему выслушать меня. Никто не слышал, что это когда-либо пробовали осуществить; никто не мог также привести разумных доводов, позволяющих понять, почему это невыполнимо. Тем не менее идея ни у кого не вызывала особого энтузиазма. До этого случая мои коллеги скептически относились к моим идеям, касающимся ДНК, и часто, поразмыслив несколько дней, я соглашался с ними. Однако на этот раз я понимал, что приблизился к чему-то значительному. Прошли месяцы, прежде чем я подготовился к своему первому эксперименту по проверке принципа ПЦР. Мне пришлось основательно поработать с литературой, чтобы правильно использовать буферные растворы, подобрать концентрации реагентов, решить, как долго следует нагревать и охлаждать реакционные смеси и т. д. Полезными оказались некоторые ранние работы Корнберга, посвященные ДНК-полимеразе. Для проведения опыта в качестве ДНК-матрицы я выбрал участок плазмидной ДНК длиной 25 нуклеотидных пар и два олигонуклеотида длиной соответственно 11 и 13 нуклеотидов. смотри рисунок N5 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это циклический процесс; в каждом цикле число молекул ДНК мишени разделяются при нагревании, потом при охлаждении с ними связываются праймеры. Затем ДНК-полимераза наращивает праймеры, присоединяя к ним нуклеотиды. В результате образуются копии цепей исходной ДНК мишени. Когда все было готово, я провел эксперимент из тех, что нравятся мне больше всего, - эксперимент, который ставится в одной пробирке и позволяет получить простой ответ: да или нет. Будет ли ПЦР амплифициро-вать выбранный мною участок ДНК? И ответ был получен: да, будет.Поздно вечером, выходя из лаборатории, я заметил, что Эл Халлуин, патентовед фирмы Cetus, все еще сидит в своем офисе. Я сказал ему, что придумал кое-что, и рассказал о ПЦР. Приблизительно из сотни людей, которым я объяснил свою идею, он был первым, кто согласился с тем, что я придумал что-то важное. Он даже захотел тут же посмотреть радиоавтограф, на котором был виден результат опыта, причем пленка была еще мокрой. Опыты, проводимые в одной пробирке, на многих людей не производят впечатления, однако Эл явно не был настроен скептически. В конце концов, интерес патентоведов к изобретениям вполне оправдан. Он выслушал мои разъяснения по поводу реакции и согласился, что они логичны. Он сам заинтересовался всем этим, предложил мне продолжить эксперименты и написать патент. Уходя, он поздравил меня. На протяжении следующих нескольких месяцев я продолжал изучать и оптимизировать ПЦР вместе в Фредом Фалуном, молодым, талантливым математиком, с которым меня познакомила моя дочь. Фред помогал мне и в первом опыте по ПЦР, обеспечивая циклические изменения температуры реакционной смеси. Для него это был, конечно, первый биохимический эксперимент и ночью после его успешного завершения мы отпраздновали это событие несколькими порциями пива. В течение следующих месяцев мы подтвердили эффективность ПЦР для плазмидной ДНК все большей длины. Наконец, мы получили из лаборатории Г. Эрлиха немного ДНК человека и провели амплификацию фрагмента, содержащего ген, присутствующий в геноме человека в количестве одной копии. В настоящее время многие из первоначальных сбоев и ошибок при постановке ПЦР преодолены. Теперь используется несколько слегка различающихся вариантов методики проведения этой реакции. Обычно я рекомендую изменять температуру реакционной смеси примерно от 98¦С, т. е. почти от точки кипения, приблизительно до 60¦С. Такие циклы могут занимать всего одну-две минуты; в ходе каждого цикла количество ДНК, с которой связываются праймеры, удваивается. Праймеры обычно имеют длину 20-30 нуклеотидов. Одно из наиболее значительных усовершенствований процесса заключается в использовании особой ДНК-полимеразы, которая первоначально была выделена из бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках. Полимераза, которую мы использовали в первых экспериментах, легко инактивировалась при нагревании, поэтому в каждом цикле реакции приходилось добавлять новую порцию фермента. Однако ДНК-полимераза Т. aquaticus стабильна и активна при высоких температурах, поэтому ее можно добавлять только один раз в начале реакции. В настоящее время эту термостабильную ДНК-полимеразу выделяют из штамма бактерий, специально сконструированного методами генной инженерии. Практически неограниченная амплификация ДНК с помощью ПЦР была настолько беспрецедентной, что не могла быть воспринята немедленно. Исследователи были не подготовлены к тому, что существует процесс, с помощью которого можно получать любую ДНК. Реакция казалась очень простой мне и Фреду, потому что была нашим детищем. Для других потребовалось время, чтобы свыкнуться с ней. Весной 1984 г., работая над патентом, я выставил стенд, посвященный ПЦР, на ежегодной научной конференции в фирме Cetus. Эти конференции всегда были очень интересными, поскольку научными консультантами в фирме работали крупнейшие ученые. Я предвкушал разговор с ними о моем открытии. Однако, казалось, мой стенд никого не заинтересовал, и я стал нервничать все больше. Люди бросали на него беглый взгляд и проходили дальше. Наконец, я заметил поблизости Джошуа Ледерберга, президента Рокфеллеровского университета, и попросил его посмотреть результаты моих опытов. Джошуа внимательно просмотрел их, а затем, повернув ко мне свою крупную голову, голову лауреата Нобелевской премии, в которой в 1946 г. родилась идея о том, что у бактерий возможен половой процесс, спросил: "И что, получается?" Казалось, он даже развеселился. Польщенный, я ответил, что да, получается. После этого мы еще долго беседовали. Он упомянул, что примерно 20 лет назад, когда Корнберг открыл ДНК-полимеразу, они обсуждали идею о том, что этот фермент можно каким-то образом использовать для синтеза больших количеств ДНК. Однако им не удалось точно представить, как именно этого можно достичь. Я напомнил ему, что в то время исследователи не могли получать нуклеотиды и, кроме того, отсутствовала какая-либо информация о последовательностях нуклеотидов в ДНК. Он вновь посмотрел на мой стенд с таким выражением, которое я почти ожидал увидеть. Я думаю, что Джошуа, поняв необыкновенную простоту полимеразной цепной реакции, оказался, вероятно, первым, у кого возникло ощущение, которое теперь возникает почти у всех молекулярных биологов и других исследователей, работающих с ДНК: "Почему я не подумал об этом?" И никто не может ответить на этот вопрос. Не могу ответить, конечно, и я. Просто однажды ночью я наткнулся на решение. Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ This page uses frames, but your browser doesn't support them. menuleft menuup manumain Инструкция по забору биологического материала для лабораторных исследований методом ПЦР. ИНСТРУКЦИЯ ПО ЗАБОРУ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ ПЦР КРОВЬ Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа Venoject (с ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:19 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9). Запрещается использовать гепарин в качестве антикоагулянта. Пробирка закрывается пробкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом). Пробирка с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4 оС. Максимальный срок хранения: При исследовании на вирусные гепатиты до 2 суток При исследовании на другие инфекции до 5 часов. Пробирки для забора крови предоставляются лабораторией. МОЧА Для анализа отбирается первая порция утренней мочи в количестве 10 мл в специальный флакон или пробирку без консервирующего раствора. Максимальный срок хранения отобранного материала 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. СЛЮНА Перед забором слюны производится трехкратное полоскание полости рта физиологическим раствором. Забор слюны производится в одноразовые пробирки в количестве 3-5 мл. Материал необходимо отбирать непосредственно перед исследованием или немедленно доставлять в лабораторию. При невозможности быстрой доставки материал замораживают при -200С. Последующая транспортировка осуществляется в замороженном состоянии (в термосе со льдом). МАЗОК ИЗ РОТОГОТКИ Забор материала производится рабочей частью стерильного одноразового аппликатора с задней стенки глотки и крипт миндалин. После забора материала аппликатор помещают в стерильную одноразовую пробирку. Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. МОКРОТА И ПЛЕВРАЛЬНЫЙ ВЫПОТ Материал отбирают в специальные флаконы в количестве 5-10 мл. Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. БИОПСИЙНЫЙ МАТЕРИАЛ Биопсийный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа "Эппендорф". Максимальный срок хранения материала: 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. СИНОВИАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ Забор материала производится одноразовым шприцом в количестве 1 мл. Отобранный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа "Эппендорф". Максимальный срок хранения материала: 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. ЗАБОР МАТЕРИАЛА ДЛЯ АНАЛИЗА НА УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ ЗАБОР МАТЕРИАЛА ДЛЯ ЖЕНЩИН СОСКОБ (МАЗОК) Забор материала производится из трех различных точек: цервикальный канал задний свод влагалища, уретра. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei). Забор производится универсальным зондом или ложкой Фолькмана. Если соскоб взят универсальным зондом, рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа "Эппендорф" с консервирующим раствором. Если забор производится ложкой Фолькмана, рабочая часть инструмента споласкивается в консервирующем растворе, содержащемся в одноразовой пробирке типа "Эппендорф". Максимальный срок хранения материала: 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. ЗАБОР МАТЕРИЛА У МУЖЧИН СОСКОБ (МАЗОК). Забор материала производится универсальным зондом из уретры. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei). Рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа "Эппендорф" с консервирующим раствором. Максимальный срок хранения материала: 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. СОК ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЫ. После окончания массажа предстательной железы сок в количестве 0,5-1 мл, собирают в одноразовую сухую пробирку типа "Эппендорф". При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится сок предстательной железы) в количестве 10 мл (правила забора мочи смотрите выше). Максимальный срок хранения материала: 1 сутки в холодильнике при температуре +40С. Пробирки для забора крови с антикоагулянтом, пробирки для забора проб на урогенитальные инфекции типа "Эппендорф" с консервирующим раствором предоставляются лабораторией бесплатно. Одноразовые универсальные зонды для забора проб на урогенитальные инфекции, одноразовые пробирки с аппликаторами для забора мазков из ротоглотки при необходимости предоставляются лабораторией. Контактные лица КОНТАКТНЫЕ ЛИЦА Раздел КОНТАКТНЫЕ ЛИЦА содержит информацию необходимую для контактов. Руководитель ПЦР лаборатории ЦНИИЭ МЗ РФ ШИПУЛИН Герман Александрович .. Консультативно-диагностический отдел .. ЧУЛАНОВ Владимир Петрович .. ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Лицензия. ЛИЦЕНЗИЯ Раздел ЛИЦЕНЗИЯ содержит информацию о праве на осуществеление медицинской деятельности Центральным НИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Серия лицензии ЦЛМД N 5623/5619. Срок действия с 29 мая 1997 года по 29 мая 2000 года. Разрешенные виды работ: в соответствие с протоколом к лицензии.Приложение: ОСНОВНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ В ЛЕЧЕБНО - ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧЕРЕЖДЕНИЯХ Диагностика: биологический контроль, лабораторная диагностика: биохимические, гематологические, генетические исследования: ДНК-диагностика, иммунологические исследования, ВИЧ-диагностика, микробиологические, вирусологические, цитогенетические, цитохимические, токсикологические, общеклинические лабораторные исследования. Амбулаторно-поликлиническая медицинская помощь взрослому населению: аллергология, инфекционные болезни, иммунология клиническая, иммунопрофилактика. Амбулаторно-поликлиническая медицинская помощь детскому населению и подросткам: аллергология, инфекционные болезни, иммунология клиническая, иммунопрофилактика. ОБЯЗАТЕЛЬНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Медицинская статистика. Организация и проведение массовой иммунизации населения. ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Социальная гигиена и организационно-методическая работа. Медико-гигиеническое образование населения: профилактическая работа с населением, профилактика ВИЧ-инфекции. Медицинский менеджмент: организация консультативно-диагностической и лечебной помощи. МЕДИКО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Повышение квалификации, специализация и переподготовка кадров (постдипломное образование): курсы информации (тематические циклы усовершенствования) по актуальным проблемам здравоорхранения для медицинских и фармацевтических работников с высшим и средним специальным образованием: новые медицинские технологии (профилактика, диагностика, лечение, медицинская реабилитация), новые диагностические средства, лекарственные и биологически активные вещества и препараты, новые медицинские приборы, аппараты, лечебно-диагностические комплексы. Менеджмент в медико-образовательной деятельности: организация учебно-методической деятельности, подготовка и внедрение учебных программ с использованием технических средств и вычислительной техники. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Новые медицинские технологии (профилактика, диагностика, лечение, медицинская реабилитация): разработка, апробация, внедрение. Новые диагностические средства, лекарственные и биологически активные вещества и препараты: разработка, апробация, внедрение. Научно-организационный менеджмент: организация научно-исследовательской медицинской деятельности, организация разработки и внедрения обучающих пограмм по новым лечебным методам и организационно-экономическим технологиям. Menu LEFT Menu MAIN Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ Добро пожаловать на главную страницу Лаборатории Молекулярной Диагностики Центрального научно - исследовательского института Эпидемиологии МЗ РФ. ОБ ИНСТИТУТЕ ЧТО ТАКОЕ ПЦР Кто мы. Где находимся. Чем занимаемся. Куда движемся. Как с нами связаться. Узнайте о нас подробнее . . Экстраординарная способность полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаруживать даже единственную молекулу ДНК в биологическом образце . НАШИ УСЛУГИ Специальное предложение для медицинских организаций и врачей. Лабораторная диагностика возбудителей инфекционных заболеваний методом ПЦР . . Необычайная история, о том как родилась полимеразная цепная реакция Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах - ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии . . НА ГРАНИ ИСКУССТВА ПЦР тест-системы для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. СПЕЦИАЛЬНОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ ДЛЯ ЛАБОРАТОРИЙ! ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ КОНТАКТОВ Контактные лица Почтовый адрес111123, Россия, г. Москва, Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ, ул. Новогиреевская, дом 3А, комната N11 Лаборатория Молекулярной Микробиологии Схема проезда Телефон +7 495 176.3939 Факс +7 495 304.2201 Режим работы Понедельник-пятница: с 10.00 час до 18.00 час Суббота-Воскресенье: выходной Адрес в Интернет http://www.pcr.ru Электронная почта info@pcr.ru WEB master webmaster@pcr.ru Главная страница Новости Оглавление Словарь Поиск по серверу Поиск Региcтрация ЦНИИЭ. Новости сервера НОВОСТИ СЕРВЕРА 3.12.99 Новый прейскурант на ПЦР-тест-системы и наборы для ПЦР 4.11.99 Новый прейскурант на диагностические услуги Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора РФ. Москва 1995 год Утверждены 22 июня 1995 Разработаны: Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора. Исполнители: Покровский В.В. Федоров Н.Л. Шипулин Г.А. Безруков В.М. Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасовича Госкомсанэпиднадзора. Исполнители: Бектимиров Т.А. Блоха В.В. Российским научно-исследовательский противочумный институт Госкомсанэпиднадзора. Исполнитель: Куличенко А.Н. Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Ученым Советом ГИСК им. Л.А. Тарасовича (протокол N 5 от 28 марта 1995 года Введено впервые Дата введения: с момента утверждения ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ1. Область применения. Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний. 2. Обоснование необходимости. Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов. Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации: Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации. Контаминация следовыми количествами ампликонов: посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств. Накопленный к настоящему моменту опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечивает исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов. 3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий. 1) Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат: пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплицификации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. 2) Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. 3) Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения. 4) В комнате приготовления реакционной снеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами. 5) Работа в лаборатории должка быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению. 6) Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку. 7) Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производится раздельно. 8) Следует однократно использовать перчатки, как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной снеси и постановки ПЦР. 9) Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси. 10) Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку. 11) Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов. 12) В пре-ПЦР- и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники. 13) Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов. 14) Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты. 15) При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М.,1980. 16) Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте: каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70 этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы. при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем - 70 этанолом. следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 70 этанолом с целью борьбы с пылью. 17) Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагносцируются в данной лаборатории. 18) Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение. 4. Требования к проведению ПЦР-анализа. 4.1. Обработка клинических образцов. 1) Забор клинических образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные. 2) Paбoтaть только в одноразовых перчатках. 3) Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. 4) Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой. 5) Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываются в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с 1 н. раствором соляной кислоты. 4.2. Постановка ПЦР. 1) Работать только в одноразовых перчатках. 2) Следует готовить смесь реактивов для ПЦР , расчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем - раскапывать ее по пробиркам. 3) Использовать автоматические пипетки с переменным объемом и одноразовые наконечники. 4) В каждый данный момент работать только с одной пробиркой. 5) Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов. 6) Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавляться в реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером в последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкость с 1 н раствором НСl. 4.3. Детекция продуктов амплификации. 1) Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью. 2) Работать следует только в одноразовых перчатках. 3) Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны находиться только в этой комнате и не должны попадать в пре-ПЦР-помещения. 4) В комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви. 5. Использование физических и химических истодов борьбы с контаминацией. 1) Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы. 2) Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 н НСl, 10% гипохлоридом натрия или 10% хлорной известью). 6. Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории. 1) Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакцией, но и другими методами диагностики данной инфекции. 2) Следует периодически проводить оценку чувствительности диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции. Образование ОБРАЗОВАНИЕ В разделе ОБРАЗОВАНИЕ представлена информация о проведении научно-методических семинаров организуемых Центральным НИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Страница находится в стадии разработки. . . Страница обновлена: document.write("") document.write(myweekday + " " + month + "19" + year + "," + day); // --> Copyright (c) 1998 Лаборатория ПЦР-диагностики ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ Вопросы и коментарии по содержанию сайта направляйте WEB мастеру по адресу: webmaster@pcr.ru Оглавление ОГЛАВЛЕНИЕ Для удобства поиска информации в разделе ОГЛАВЛЕНИЕ представлены все разделы сайта ЦНИИ Эпидемиологии. Щелкнув мышкой по интересущей теме Вы сразу окажитесь на нужной странице. .. Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФГлавная страница Оглавление Поиск Словарь Регистрация Об институте Лицензия Адрес, реквизиты Контактные лица Схема проезда Диагностика Наши услуги Прейскурант Правила забора материала для исследования ПЦР Тест-системы AmpliSens Ресурсы Образование Библиография Что такое ПЦР Как открыли ПЦР Страница обновлена: document.write("") document.write(myweekday + " " + month + "19" + year + "," + day); // --> Copyright (c) 1998 Центральный НИИ Эпидемиологии МЗ РФ Вопросы и коментарии по содержанию сайта направляйте по адресу: webmaster@pcr.ru Регистрация РЕГИСТРАЦИЯ Раздел РЕГИСТРАЦИЯ позволит Вам быстро получать информацию о новых услугах и передовых разработках нашей лаборатории. [FrontPage Save Results Component] Страна Регион Область Индекс Город Улица . Фамилия И.О. Должность Специальность Место работы E-mail URL Телефон Факс Комментарии Пожалуйста, свяжитесь со мной как можно быстрее. Ресурсы РЕСУРСЫ страница находится в стадии разработки Страница поиска Поиск по серверу WWW.PCR.RU Текст для поиска: Вид: И ИЛИ Регистр: Без учета С учетом Где: Везде Показать образец текста * Поиск MEDLINE AIDSLINE TOXLINE Бесплатный поиск по базам данных MEDLINE, AIDSLINE, TOXLINE позволит Вам найти самую свежую информацию по интересующей Вас теме в зарубежных медицинских журналах/. Введите ключевое слово на английском языке Искать в: Все записи Заголовок Автор Журнал Краткий обзор Год Mesh Hd Уникальный ID AND OR NOT ADJ Все записи Заголовок Автор Журнал Краткий обзор Год Mesh Hd Уникальный ID AND OR NOT ADJ Все записи Заголовок Автор Журнал Краткий обзор Год Mesh Hd Уникальный ID AND OR NOT ADJ Все записи Заголовок Автор Журнал Краткий обзор Год Mesh Hd Уникальный ID Выводить 10 25 50 100 записей на страницу 2. Выберите базу данных: MEDLINE 98-99 (Включая еженедельное обновление) MEDLINE 95-97 MEDLINE 93-94 MEDLINE 90-92 MEDLINE 85-89 MEDLINE 80-84 MEDLINE 75-79 MEDLINE 66-74 TOXLINE AIDSLINE CANCERLIT 3. Выберите язык публикации: Все Английский Русский Африканский Болгарский Китайский Чешский Датский Голландский Английский Французский Немецкий Иврит Венгерский Итальянский Японский Корейский Норвежский Польский Потругальский Румынский Словацкий Испанский Шведский Украинский 4. Выберите тип публикации: Всё Краткий обзор Библиография Статья Клиническая конференция Клиническое испытание Клиническое испытание. Фаза I Клиническое испытание. Фаза II Клиническое испытание. Фаза III Клиническое испытание. Фаза IV Комментарии Консенсус-конференция Консенсус-конференция NIH Контролируемое клиническое испытание Повторно опубликованная статья Биография-некролог Словарь Указатель Дублированная публикация Редакционная статья Тезисы на английском языке Юбилейный сборник Руководство Историческая статья Историческая биография Интервью Журнальная статья Юридическая сводка Письмо Отчет о конференции Мета-анализ Монография Многоцентровое исследование Новости Газетная статья Полный отчет о конференции Указатель периодических изданий Практическое руководство Опубликованная опечатка Рандомизированное исследование Отозванная публикация Сокращенная публикация Обзор Обзор литературы Обзор опубликованных случав Обзор академический Обзор большого числа случаев Обзор учебный Методическая статья Исследование близнецов 5. Выберите возрастную группу Все Новорожденные (от рождения до 1 месяца) Младенцы (от 1 до 23 месяцев) Дети, Дошкольники (от 2 до 5 лет) Дети (от 6 до 12 лет) Подростки (от 13 до 18 лет) Дети (от новорожденных до 18 лет) Взрослые (от 19 до 44 лет) Средний возраст (от 45 до 64 лет) Пожилые (от 65 до 79 лет) Старики (80 лет и старше) Взрослые (19 лет и старше) . Искать только: публикации на английском языке публикации, касающиеся человека . Библиотеки ON-LINE Библиотеки ON-LINE ASM Journals Online Springer LINK Научная электронная библиотека Journal of Clinical Microbiology Схема проезда СХЕМА ПРОЕЗДА ПЦР тест-системы AmpliSens ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ Раздел ТЕСТ-СИСТЕМЫ AMPLISENS для диагностики вобудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции. Вы решили создать собственную ПЦР-лабораторию. Мы поможем Вам правильно ее организовать, купить лучшее отечественное или зарубежное оборудование по реальным ценам, обучить специалистов, наладить контроль качества закупаемых Вами тест-систем и проведения анализа в Вашей лаборатории. ПЦР-тест-системы семейства АмплиСенс Наборы, прошедшие клиническую апробацию и находящиеся на стадии регистрации или подачи на регистрацию. Посмотреть Прейскурант (Microsoft Word 97)Вы можете скачать Прейскурант на ПЦР-тест-системы и наборы для ПЦР - с 1 декабря 1999 года. price_t.zip в формате Microsoft Word 97. Если у Вас возникнут трудности с этим файлом, мы можем выслать вам Прейскурант в удобном для Вас формате по электронной почте. Все вопросы по ПЦР-тест-системам и наборам для ПЦР присылайте по адресу amplisens@pcr.ru Наши услуги НАШИ УСЛУГИ . Уважаемые коллеги! Лаборатория молекулярной диагностики инфекционных заболеваний создана в 1992 г. на базе Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИД при Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Минздрав РФ. Задачами лаборатории являются разработка, испытание, стандартизация и внедрение молекулярно-биологических методов диагностики и мониторинга инфекционных заболеваний, а также проведение практической лабораторной диагностики. В настоящее время в нашей лаборатории выполняется анализ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ИФА по обнаружению самого широкого спектра возбудителей вирусных, бактериальных и грибковых инфекций человека и проводится оценка иммунного статуса методом проточной цитофлуорометрии. Только у нас Вы можете провести полную этиологическую расшифровку инфекционных гепатитов, включая недавно обнаруженные вирусные гепатиты, ассоциированные с вирусами гепатита G и TTV. Вирусный гепатит D - грозное и частое осложнение вирусного гепатита В - выявляется в нашей лаборатории c помощью как ИФА, так и ПЦР, что позволяет не только диагностировать D-инфекцию, но и судить о ее активности и роли в патогенезе гепатитов смешанной этиологии. Группой генотипирования нашей лаборатории освоены молекулярно-генетические методы типирования вирусов гепатита B и С. Поскольку часто обнаруживается несовпадение результатов в различных системах генотипирования, для определения генотипа изолятов вируса гепатита С нами используется параллельно две системы Ohno T. (...) и Okamoto H. (...), позволяющие детектировать 9 наиболее часто встречающихся генотипов - 1а, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, 6a. Генотипирование изолятов вируса гепатита В осуществляется нами по пре-S области и позволяет выявить все известные на сегодняшний день генотипы (A-F). Герпесвирусы - еще одна группа вирусов, практически целиком охваченная в наших исследованиях. Специфика работы с этой группой вирусов заключается в их широкой распространенности и латентном течении инфекционного процесса, что приводит к образованию специфических антител, выявляемых методами серологической диагностики у большинства здоровых людей. Нарушение функционирования иммунной системы является главной причиной активизации герпесвирусов, обнаружить которую у этой группы пациентов с помощью серологических методов не представляется возможным (...). К сожалению качественное обнаружение герпесвирусов прямыми методами диагностики, включая ПЦР, также не позволяет определять их активность. Пятилетний клинический и лабораторный опыт работы с ВИЧ-инфицированными пациентами и пациентами с иммунодефицитами неинфекционной этиологии позволили нам предложить эффективный способ диагностики активных форм герпесвирусных инфекций, основой которого стало исследование иммунного статуса в сочетании с полуколичественным определением величины вирусной нагрузки герпесвирусов методом ПЦР (...). ДНК-диагностика урогенитальных инфекций также является традиционной сферой деятельности нашей лаборатории. Мы можем предложить не только выявление возбудителей заболеваний передаваемых половым путем, но и мониторинг проводимой терапии. Отличительной чертой методик, разработанных и применяемых нами для этих целей, является практически полное отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных реакций. Данное достижение стало возможным благодаря введению в практику нашей работы передовых технологий проведения ПЦР-анализа - использованию внутренних стандартов на всех стадиях ПЦР и "стерилизации" реакционных смесей посредством их предобработки ферментом урацилгликозидазой, клонированном в нашей лаборатории. Гарантией качества наших исследований является предоставление отчетов по каждому анализу, выполняемых с помощью системы компьютерного видеодокументирования результатов, разработанной в нашей лаборатории. Как известно, даже самые точные методики не застрахованы от ошибок врачей-лаборантов. Вот почему мы уделяем такое большое внимание внутрилабораторному контролю качества выполняемых анализов. Многоуровневая система контроля была создана нами благодаря разработке методов конструирования отраслевых стандартных образцов для ДНК-диагностики, лидерами в изготовлении и стандартизации которых, мы являемся. Лаборатория молекулярной диагностики инфекционных заболеваний Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИД при Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Минздрав РФ действует в рамках устава института и имеет лицензию на ДНК-диагностику. Все методики, использующиеся в лаборатории, прошли апробацию на клинических базах ЦНИИ эпидемиологии. Работа в подразделении ведется согласно нормативному документу "Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции" разработанного на основе многолетнего опыта нашей лаборатории и утвержденного Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ в 1995 г (....). В настоящее время свыше 30 Московских клиник и около 20 медицинских фирм пользуются услугами нашей лаборатории. В 1997 г. лаборатория стала официальной базой для проведения Государственных испытаний ведущего мирового производителя ПЦР-тест-систем фирмы "Hoffmann La Roche". С марта 1997 г. нашим партнером является фирма "Shering-Plоugh, доверившая нам мониторинг эффективности противовирусной терапии вирусного гепатита С Интроном А. По любым вопросам, касающимся наших услуг и сотрудничества, пожалуйста, звоните нам по тел. (495)-176-3939, (495)-304-2201. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ОБНАРУЖЕНИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ОБНАРУЖЕНИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С. Н.А. Федоров, В.П. Чуланов, Е.В. Волчкова, А.Х. Асаци Мобархан, О.К.Шеремет Лаборатория ПЦР-генодиагностики Центрального НИИ эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ, кафедра инфекционных болезней медико-профилактического факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, НПО 'Авиценна', Москва Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Российская Академия медицинских наук. N 4 том 3 1995 Вирус гепатита С (ВГС) ? оболочечный вирус с размером частиц 30-80 нм. Геном ВГС представляет собой однонитевую РНК с позитивной полярностью длиной около 9500 нуклеотидов [9], имеющую 5'-нетранслируемую область, длинную рамку считывания, кодирующую полипептид, состоящий из ЗОН аминокислот, 3'-нетранслируемую область и 3'-концевую поли(А)- или поли(U)-последователь-ность (в зависимости от изолята) [9]. Такая организация генома близка по структуре к организации генома флави- и пестивирусов, инфицирующих как животных, так и человека. Механизм и продукты посттрансляционного процессинга полипептида не до конца ясны. Установлено, что три N-концевых белка (С, Е1,Е2 ) являются структурными, шесть неструктурных С-концевых белков (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b) необходимы для реплика-ции вируса [19]. Начиная с 1989 г., в разных странах мира было выделено и секвенировано более 70 изолятов ВГС. Основываясь на степени гомологии нуклеотидных последовательностей области С изолятов, H.Okamoto и соавт. впервые разделили их на четыре генотипа (1-IV); позднее были выделены V и VI генотипы [14]. Однако классификации разных лабораторий не совпадали, что не позволяло проводить сравнительную оценку результатов. P.Simmonds и соавт. предложили единую номенклатуру, основываясь на филогенетическом анализе области NS5 . Пока вопрос о классификации ВГС остается открытым. Сравнительный анализ изолятов показал, что наиболее консервативными областями генома являются 5'-нетранслируемая область и ген С, тогда как область, кодирующая белки оболочки Е1 и Е2, область NS2 и 3'-нетранслируемая область гипервариабельны. Предполагают, что ВГС циркулирует в сыворотке крови в концентрации 102 ? 107^ частиц в 1 мл [20], следовательно, обнаружить вирусные антигены (АГ) с помощью общепринятых методов невозможно. В связи с этим детекция антител (AT) к ВГС стала основным методом диагностики этой инфекции. Все используемые в настоящее время иммуноферментные тест-системы изготовлены на основе рекомбинантных или синтетических полипептидов, несущих антигенные детерминанты белка нуклеокапсида (ген С) и/или неструктурных белков NS3, NS4. В тест-системы третьего поколения введен белок области NS5, что повысило чувствительность анализа. Однако иммуноферментный метод неэффективен в ранней диагностике заболевания, так как AT в улавливаемых титрах появляются в среднем через 6-8 нед (ELISA, второе поколение). При этом закономерности в появлении AT к тем или иным АГ не установлено. В исследованиях динамики антителообразования LR. Overby и соавт. выделили две группы пациентов. В первой группе наблюдалась ранняя сероконверсия к АГ нуклеокапсида (С) (на 5-й неделе), тогда как AT к неструктурным белкам NS3 и NS4 появлялись в среднем только к 17-й неделе. Во второй группе AT к белкам NS3 и NS4 отмечались к 8-й неделе, а сероконверсия к АГ нуклеокапсида не наблюдалась вообще. Около 20% хронически инфицированных имеют низкие титры AT [19] и около 10% могут быть серонегативными. Кроме того, AT в улавливаемых титрах могут отсутствовать у лиц с иммунодефицитом вследствие ВИЧ-инфекции, иммуносупрессивной терапии и др., а также у новорожденных вследствие слабости иммунного ответа или врожденной иммунной толерантности. При иммуноферментном анализе возможны ложноположительные результаты. Это наблюдается при наличии в анализируемом образце AT к супероксиддисмутазе (например, у больных хроническим активным аутоиммунным гепатитом), совместно с которой в рекомбинантных дрожжевых клетках синтезируется белок с 100-3, использующийся в качестве АГ в иммуноферментных тест-системах. Ложноположительные результаты выявляются также у больных с гипергаммаглобулинемией, наблюдающейся у африканцев, больных системными заболеваниями соединительной ткани, миеломной болезнью, гепатоцеллюлярной карциномой, хроническими заболеваниями печени. Имеются сообщения о ложноположительных результатах после повторного размораживания образцов или в случае их длительного хранения при нестабильной температуре [24,26]. В исследованиях не обнаружено корреляции между появлением AT к тем или иным белкам ВГС и стадией заболевания, течением процесса и жизненным циклом вируса, следовательно, обнаружение AT не имеет никакой прогностической ценности, а отражает лишь наличие текущей или перенесенной инфекции. Как свидетельствуют научные публикации последних лет, большинство проблем иммуноферментного анализа может быть решено благодаря внедрению современных достижений технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностику ВГС-инфекции. ПЦР-анализ биологических образцов на присутствие РНК ВГС состоит из нескольких этапов: выделение РНК из пробы, реакция обратной транскрипции для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК, ПЦР и детекция продуктов ПЦР. Выделение РНК ВГС необходимо для того, чтобы сконцентрировать ее и исключить ингибирующее влияние на ферменты сопутствующих веществ. В большинстве работ с целью выделения РНК ВГС используют различные модификации гуанидинтиоцианатного и фенолхлороформного методов. Методы позволяют выделять РНК из любого биологического материала, однако они достаточно трудоемки, а из-за неоднократного переноса пробы из пробирки в пробирку увеличивается риск контаминации, а следовательно, и получения ложноположительных результатов. Для выделения РНК из лейкоцитов крови пробы можно обрабатывать протеиназой К с последующей фенолхлороформной очисткой. Относительно дешевый и эффективный метод ? использование в качестве хаотропного агента 8М раствора мочевины. Недостатком его является необходимость приготовления буфера ддя экстракции РНК ex tempore [22]. Для выделения РНК ВГС из небольшого количества ткани иногда применяют раствор LiCI-мочевины. Перспективный метод экстракции вирусной РНК ? абсорбция ее на частицы силикагеля после денатурации образца гуанидинтиоцианатом [3]. Некоторые авторы производят выделение РНК путем ультрацентрифугирования в градиенте CsCI [13]. Этот метод неприменим для обработки клинического материала, так как требует больших затрат времени и сложного оборудования. Имеются сообщения о возможности проведения ПЦР без предварительного выделения РНК в 3 мкл сыворотки крови [7], при этом не наблюдается выраженного снижения активности фермента. Однако опыт нашей лаборатории показывает, что чувствительность такой методики низка, особенно при исследовании образцов с невысоким уровнем виремии [неопубликованные данные]. Наиболее перспективными являются методы "вылавливания" РНК ВГС из биологического образца специфическими олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на твердом носителе (capture RT-PCR), которые одновременно могут служить праймерами для ревертазы. Благодаря этому значительно упрощается методика и уменьшается время, необходимое для проведения анализа. В качестве носителя могут быть использованы аффинные мембраны. L.-J.Van Doom и соавт. предлагают модифицированную методику с использованием магнитных шариков, покрытых стрептовидином, которые захватывают связавшиеся с вирусной РНК биотинилированные олигонуклеогидные зонды [23]. В подавляющем большинстве работ в реакции обратной транскрипции использовали один из двух ферментов: обратную транскриптазу вируса лейкоза мышей (M-MuLV - RT) или обратную транскриптазу вируса миелобдастоза птиц (AMV - RT). Как правило, с целью достижения оптимальных условий для проведения реакций обратную транскрипцию и ПЦР проводят в разных пробирках, при этом при переносе проб возрастает риск перекрестной контаминации. Для решения этой проблемы была предложена методика комбинирования реакции обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке с разделением реакционных смесей во время синтеза кДНК слоем специального парафина [21]. Исследователи из Roche Molecular Systems (США) разработали комбинированный метод РНК-ПЦР с использованием фермента Tth-полимеразы (выделенного из термофильной бактерии Thermus thermophihis), который наряду с полимеразной активностью обладает менее выраженной ревертазной активностью, что позволяет проводить реакцию обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке с участием одного фермента. В классической ПЦР в качестве фермента используют Taq-полимеразу (выделенную из Thermus aquaticus), способную выдерживать, нагревание до 95 ¦С и имеющую температурный оптимум 72¦С. Наряду с общепринятой одностадийной ПЦР для обнаружения РНК ВГС применяют ее модификации, позволяющие повысить чувствительность реакции. Так, широко используют двухстадийную ПЦР с внутренней парой праймеров (nested-PCR) [17,22,26], что способствует значительному увеличению чувствительности реакции, но при этом значительно возрастает риск перекрестной контаминации. С целью уменьшения этого риска С. Feray и соавт.[4] проводили обе стадии ПЦР в одной пробирке, однако при этом снижалась эффективность реакции. Возможно также применение методики ПЦР с двумя парами праймеров на разные области генома. Выбор праймеров для проведения РНК-ПЦР- биологическом материале ВГС, как правило, используют праймеры на высококонсервативные области генома, обычно 5'-нетранслируемую область. С помощью ПЦР возможно генотипирование ВГС посредством использования типоспецифических праймеров [22]. Это имеет большое значение в эпидемиологических исследованиях и оценке прогноза противовирусной терапии. Так, отмечено, что генотип III ВГС более чувствителен к лечению интерфероном, чем генотип II [7). В последние годы в связи с возросшим интересом к динамическому наблюдению за уровнем виремии бурное развитие получили полуколичественные и количественные методы РНК-ПЦР [22]. Детекцию продуктов амплификации проводят путем электрофореза в геле с окрашиванием бромистым этидием или с применением различных модификаций гибридизационной методики [8]. При детекции продуктов ПЦР посредством гибридизации с олигонуклеотидными зондами увеличивается как чувствительность, так и специфичность анализа. D.R.Gretch и соавт.[8] считают, что одностадийная ПЦР с последующей гибридизацией по чувствительности не уступает двухстадийной ПЦР с внутренней парой праймеров и предпочтительна при клинической диагностике, так как способствует уменьшению риска перекрестной контаминации. Клиническое значение ПЦР-диагностики ВГС-инфекции. Детекция виремии. В исследованиях на шимпанзе показано, что РНК ВГС появляется в плазме крови через 3-4 дня после заражения. У больных РНК ВГС в детектируемых количествах обнаруживают в плазме крови уже в течение 1-й недели после предполагаемого заражения [24]. Это позволяет диагностировать острый гепатит С задолго до сероконверсии. Несмотря на то что у большинства пациентов с серологически подтвержденным хроническим гепатитом С в сыворотке крови обнаруживают РНК ВГС, у части из них не выявляют детектируемые уровни вирусной РНК. Предполагают, что это может быть следствием перемежающейся виремии [19]. При обследовании больных, находящихся на гемодиализе, установлено, что около 30% из них, у которых в сыворотке крови методом ПЦР обнаружены РНК ВГС, серонегативны [19]. В связи с ненадежностью серологических методов поднимается вопрос о необходимости использования ПЦР в качестве скринингового метода при обследовании лиц, входящих в группы риска, и доноров крови. Нами в пяти ИФА-тест-системах были исследованы 88 образцов сыворотки крови (доноры ? 27, больные гепатитом С ? 37, панель стандартных сывороток на атитела ВГС, "Вектор Бест", Новосибирск,-24). Для детекции ВГС с помощью ПЦР были отобраны 9 сывороток, результаты исследования которых в разных тест-системах не совпадали (первая группа), и 12 сывороток, положительных по всем тест-системам (вторая группа). В первой группе обнаружено 3 (33,3%) ПЦР-положительные сыворотки, одна из которых.серонегативная по четырем тест-системам, принадлежала донору крови. Во второй группе выявлены 3 (25%) ПЦР-отрицательные сыворотки [1]. Таким образом, около 30% сывороток, при исследовании которых получен отрицательный результат (хотя бы в одной ИФА-тест-системе), содержали РНК ВГС, что свидетельствует о необходимости использования ПЦР для решения вопроса о наличии виремии, особенно при исследовании донорской крови. ПЦР считают наиболее надежным методом контроля ВГС-инфекции при трансплантации органов [8]. Амплификация гипервариабельной области Е2 до и после трансплантации печени с последующим анализом гомологии нуклеотидных последовательностей позволяет установить, "был ли трансплантат реинфицирован вирусом, находящимся в организме реципиента, или вирусом, внесенным извне. Y. Kobayashi и соавт.[11] считают, что уровень виремии до лечения интерфероном является более важным показателем прогноза терапии, чем генотип ВГС, ввиду высокой частоты смешанного инфицирования различными подтипами вируса. Детекция репликации ВГС. Предполагают, что промежуточным продуктом репликации ВГС является минус-цепь РНК. При сопоставлении наличия плюс- и минус-цепей РНК ВГС в ткани печени, периферических мононуклеарных лейкоцитах и сыворотке крови было установлено, что минус-цепь выявляют только в том случае, если присутствует также плюс-цепь, тогда как плюс-цепь может быть обнаружена в отсутствие минус-цепи [6]. Это свидетельствует о том, что выявление позитивной цепи РНК ВГС не может служить критерием репликации ВГС, а отсутствие при этом минус-цепи, по-видимому, указывает на то, что вирус находится в нерепликативной стадии. В ряде работ определяли наличие минус-цепи РНК ВГС в периферических мононуклеарных лейкоцитах. Хотя наличие промежуточных продуктов репликации ВГС в лейкоцитах может быть результатом фагоцитоза, в недавно проведенных исследованиях получены доказательства того, что ВГС реплицируется в периферических мононуклеарных лейкоцитах [13]. Кроме того, доказано, что активация и/или пролиферация этих клеток может инициировать репликацию вируса, находящегося в латентной стадии. Местом преимущественной репликации ВГС, несомненно, является гепатоцит. Полуколичественная оценка с помошью метола РНК-ПЦР показала, что у больных хроническим гепатитом С концентрация плюс- и минус-цепей РНК ВГС в ткани печени соответсвенно в 100 и 500 раз выше, чем в периферических мононуклеарных лейкоцитах [6]. С помощью ПЦР было установлено, что после обработки разведенной плазмы крови антителами к липопротеинам низкой плотности (ЛНП) РНК ВГС в значительно большем количестве содержится в иммунопреципитатах , чем в супернатанте [25]. Способность ВГС связываться с ЛНП может служить возможным объяснением гепатотропности вируса, так как печень является основным органом, участвующим в метаболизме липопротеинов. Однако вопрос о возможных местах репликации ВГС до конца не решен. H.-H.Feucht и соавт. [5] обнаружили значительно большее количество вирусной РНК в слезной жидкости по сравнению в плазмой крови. Механизм избирательного накопления вируса в слезной жидкости пока не установлен. Роль ВГС в развитии аутоиммунных и внепеченочных синдромов. В литературе имеются противоречивые данные о наличии AT к ВГС у больных хроническим активным аутоиммунным гепатитом. Так, AT к ВГС, часто обнаруживаемые у пациентов с -первым типом аутоиммунного гепатита, ассоциированного с AT к гладкой мускулатуре, исчезают в процессе иммуносупрессивной терапии, когда титр иммуноглобулинов снижается. При аутоиммунном гепатите второго типа, ассоциированном с печеночными и почечными микросомальными AT, наличие AT к ВГС подтверждается с помощью иммуноблотинга в 75% случаев [23]. Считают, что серологические методы исследования у пациентов с аутоиммунным гепатитом ненадежны, и для подтверждения этиологической роли ВГС и решения вопроса о назначении противовирусной терапии необходимо применение ПЦР [18]. РНК ВГС была обнаружена в криопреципитатах и сыворотке крови больных с криоглобулинемией второго типа. Установлено, что терапевтическая эффективность а2а-интерферона при этом заболевании тесно связана с его антивирусной активностью [12] и что ВГС участвует в развитии патологического процесса независимо от тяжести поражения печени. ВГС может быть важным фактором в возникновении мембранопролиферативного гломерулонефрита; в развитии поражения почек участвуют иммунные комплексы, содержащие вирусную РНК, что было доказано с помощью РНК-ПЦР [7]. Хроническую ВГС-инфекцию считают возможным триггерным механизмом в развитии поздней порфирии кожи. С использованием РНК-ПЦР установлено, что у большинства больных с синдромом Шегрена его возникновение не связано с ВГС. Таким образом, РНК-ПЦР пока является единственным высокочувствительным методом диагностики острого гепатита С и обнаружения больных серонегативным хроническим гепатитом С. РНК-ПЦР дает возможность провести генотипирование ВГС и количественную оценку уровня виремии, что позволяет выбрать наиболее благоприятный момент для начала противовирусной терапии и прогнозировать ее исход. С помощью РНК-ПЦР можно обнаружить репликацию ВГС, установить этиологическую и патогенетическую роль ВГС в различных внепеченочных синдромах. Упрощение, стандартизация и, возможно, автоматизация этого метода позволят использовать его при исследовании донорской крови и трансплантируемых органов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Асади Мобархан А.Х., Авдюхова Н.А., Максимова Р.Ф. и др. Сравнительный анализ результатов, полученных пятью иммуноферментными тест-системами на антитела к вирусу гепатита С и методом ПЦР на наличие РНК вируса гепатита С в группах доноров крови богьных гепатитом С // Тезисы докл. научно-практической конференции "Гепатит В,С и D ? проблемы изучения, диа-пюстаки, лечения и профилактики". М. ? С.18. 2. Artini М., Natoli G., Avantaggiati M.L. et al. //Arch. Vuol. - 1993. - Vol.8, ¦2. - P.23-29. 3. Cfieung R.C., Malsui S.M., Greenberg H.B. // J. Clin. Miciobiol. - 1994. - Vol.32, ¦10. - P.2593-2597. 4. Dusheiko G.M., lino Sh. // Vital hepatitis and liver disease/ Eds.K.Nisioka, H.Suzuki.S.Mishiro, T.Oda. -Tolao, 1994. - P.286-291. 5. Feucht H.-H., Poliwka S., Zollner B.et al.// Micro-biol. Immunol. - 1994. - Vol.38, ¦2. - P.157-158. 6. Gil В., Qian С., Menw-Bo] J.I. et al. // Hepatology. - 1993. - Vol. 18, ¦5. - P.1050-1054. 7. Greteh D.R., Johonson R.J., Yamabe H. et al. // Viral hepatitis and liver disease / Eds.K. Nisioka, H. Suzuki, S. Mishiro, T.Oda. ? Tokio, 1994. ? P.218-221. 8. Greteh D.R., Wllson J.I., Carithers R.L. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol.31, ¦2. - P.289-291. 9. Houghton М., Choo Q.-L., Kuo G. et al. // Viral hepatitis and liver disease/Eds.K.Nisioka, H.Suzuki, S.Michiro, T.Oda. - Tokio, 1994. - P.33-37. 10. Kato N., Pfeifer-Ohlsson S., Kato M. et al. //'J. Virol. - 1987. - Vol.61. - P.2182-2191. 11. Kobayashi Y., Watanabe S., Konisht M. et al. // Hepatology. - 1993. - Vol.l8, ¦6. - P.1319-1325. 12. Misiani R., Bellavita P., Fenili D. et al. // N. Engl. J. Med. - 1994. - Vol.33, ¦11. - P.751-756. 13. Mutter H.M., Pfaff E., Goeser T. et al. // J. Gen. Virol. - 1993. - Vol.74. - P.669-676. 14. Okamoto H., Kurai K., Okada S. et al. // Virology. - 1991. - Vol. 188. - P.331-341. 15. Okamoto H., Sugiyama Y., Okada S. et al. // J. Gen. Virol. -1992. - Vol.73. - P.673-679. 16.Pereini B.J.G., Milford E.L., Kirkman R.L. et al. // N. Engl. J. Med. - 1992. - Vol.327, ¦13. -P.910-915. 17. Ravaggi A., Primi D., Cariani E.I'/1. PCR Methods and Appi.- 1992. - Vol.l. - P.291-292. 18. Schmilovitz-Weiss H., Levi M., Thompson N. et al.// Gut. - 1^93. - Soppi. - P.26-35. 19. SeeligR., Renz M., Seetig H.P. // Ann.Med. - 1992. - Vol.24. - P. 225-230. IO.Simmonds P., Zhang L.Q., Watson KG. et al.// Lancet. -1990.- Vol.336. - P.1469-1472. 21. Tllston P., Corbitt G. II J.Virol.Methods. - 1993. -Vol.44, ¦1. - P.57-65. 22. Ulrich P.P., Romeo J.M., Daniel L.J. et al. // J.PCR Methods and Appi. ? 1993. ? Vol.2. ? P.241-249. 23. Van Doom L.-J., Kleter B., Voermans J. // J.Med. Virol. - 1994. - Vol.42, ¦1. - P.22-28. 24. Weiner A.J., Shyamala V., Hall J.E. et al. //Diagnosis of hum an viruses by polimerase chain reaction technology / Eds. Y.Becker, G.Darai. ? Berlin, 1992. - P.86-100. 25. Yoshikura H., Hijikata M., Shimiw Y. // Viral hepatitis and liver disease / Eds.K. Nisioka, H. Suzuki, S.Mishiro, T. Oda.- Tokio, 1994. - P. 101-103. 26. Zhang H.Y., Kuramoto I.K., Mamish D. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol.31. - P.606-609. Информативность различных маркеров гепатита В. Информативность различных маркеров гепатита B. Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Чуланов В.П., Алленов М.Н. ММА им.Сеченова, Москва МАТЕРИАЛЫ VII СЪЕЗДА ВСЕРОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА. ЭПИДЕМИОЛОГОВ, МИКРОБИОЛОГОВ И ПАРАЗИТОЛОГОВ Всероссийское общество эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Министерство здравоохранения Российской Федерации Российская академия медицинских наук. ТОМ N2, Москва 28-31 января, 1997 В настоящее время нет однозначного мнения о диагностической значимости различных маркеров вирусного гепатита В. С целью уточнения соотношения маркеров гепатита В (HbsAg, HbeAg, анти-HBcor-lgM, aнти-НВсог-суммарные) были изучены 2 группы больных: 1 группа - 21 больной острых гепатитом В (ОГВ) с обследованием на НВsAg и HBeAg; 2 группа - 23 больных ОГВ с невыявленным HBsAg в острый период заболевания, у которых исследовали анти-НВсог-lgM анти-НВсог-суммарные и HBeAg. Определение HBsAg проводили методом ИФА с использованием отечественной тест-системы АО "Вектор-Бест" (г.Новосибирск), aнти-HBcor-IgMи анти-НВсог-сумм. - иммуноферментными тест-системами научно-производственного объединения (г. Нижний Новгород), HBeAg маркировался тест-системой] HBeAg ЕIА (США). Контролем служила реакция ПЦР по выявлению HBV ДНК в сыворотке крови обследованных больных. В результате установлено, что в 1-ой группе у больных с положительным HBsAg-HBeAg выявлен только у одного, несмотря на положительную реакцию на HBV ДНК методом ПЦР. Во 2-ой группе - на фоне отрицательного HbsAg oпpeдeлeны как анти-НВсог-lgM, так и анти-НВсог-суммарные и только у 2-х больных установлен HBeAg. Данные результаты свидетельствуют, что при обследовании лиц с активной репликацией вируса гепатита В, постановка только одной реакции на HBsAg может привести к диагностическим ошибкам. Особо следует отметить низкую информативность выявления HBeAg. На наш взгляд, только сочетание постановки реакций на HBsAg, анти-НВсог-lgM и анти-НВсог-суммарные может обезопасить банки крови от инфицированности HBV. Информативность различных маркеров гепатита В. Информативность различных маркеров гепатита B. Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Чуланов В.П., Алленов М.Н. ММА им.Сеченова, Москва МАТЕРИАЛЫ VII СЪЕЗДА ВСЕРОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА. ЭПИДЕМИОЛОГОВ, МИКРОБИОЛОГОВ И ПАРАЗИТОЛОГОВ Всероссийское общество эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Министерство здравоохранения Российской Федерации Российская академия медицинских наук. ТОМ N2, Москва 28-31 января, 1997 В настоящее время нет однозначного мнения о диагностической значимости различных маркеров вирусного гепатита В. С целью уточнения соотношения маркеров гепатита В (HbsAg, HbeAg, анти-HBcor-lgM, aнти-НВсог-суммарные) были изучены 2 группы больных: 1 группа - 21 больной острых гепатитом В (ОГВ) с обследованием на НВsAg и HBeAg; 2 группа - 23 больных ОГВ с невыявленным HBsAg в острый период заболевания, у которых исследовали анти-НВсог-lgM анти-НВсог-суммарные и HBeAg. Определение HBsAg проводили методом ИФА с использованием отечественной тест-системы АО "Вектор-Бест" (г.Новосибирск), aнти-HBcor-IgMи анти-НВсог-сумм. - иммуноферментными тест-системами научно-производственного объединения (г. Нижний Новгород), HBeAg маркировался тест-системой] HBeAg ЕIА (США). Контролем служила реакция ПЦР по выявлению HBV ДНК в сыворотке крови обследованных больных. В результате установлено, что в 1-ой группе у больных с положительным HBsAg-HBeAg выявлен только у одного, несмотря на положительную реакцию на HBV ДНК методом ПЦР. Во 2-ой группе - на фоне отрицательного HbsAg oпpeдeлeны как анти-НВсог-lgM, так и анти-НВсог-суммарные и только у 2-х больных установлен HBeAg. Данные результаты свидетельствуют, что при обследовании лиц с активной репликацией вируса гепатита В, постановка только одной реакции на HBsAg может привести к диагностическим ошибкам. Особо следует отметить низкую информативность выявления HBeAg. На наш взгляд, только сочетание постановки реакций на HBsAg, анти-НВсог-lgM и анти-НВсог-суммарные может обезопасить банки крови от инфицированности HBV. Частота обнаружения РНК вируса гепатита G ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА G (HGV) У НАРКОМАНОВ, БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ. В.П. ЧУЛАНОВ, Г.А. ШИПУЛИН, О.Ю. ШИПУЛИНА, С.Л. МАКСИМОВ, Е.В. ВОЛЧКОВА Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, кафедра инфекционных болезней МПФ, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Московская клиническая инфекционная больница N2. Вирус гепатита G (HGV или GBV-C) - недавно открытый РНК вирус из рода Flaviviridae с парентеральным механизмом передачи. Коммерческие тест-системы для обнаружения вируса отсутствуют, и частота его встречаемости в России не изучена. Нами было выполнено выравнивание и анализ всех известных в настоящее время в мире нуклеотидных последовательностей изолятов вируса (54 изолята по базе данных GeneBank) с целью поиска наиболее консервативной области генома для выбора праймеров. В результате были сконструированы праймеры, комплементарные 5'-нетранслируемой области генома вируса. Это позволило разработать методику на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения HGV. С целью изучения частоты встречаемости вируса в группах риска, нами были исследованы образцы крови 112 наркоманов, поступивших инфекционную больницу с клиникой вирусного гепатита. Все пациенты были проанализированы на наличие маркеров вирусных гепатитов В и С методом ИФА и на присутствие в плазме крови РНК HCV, ДНК HBV, РНК HGV методом ПЦР. РНК HGV была обнаружена у 46 (41%) пациентов. Из них у 20 (43%) была выявлена РНК HCV и у 13 (28%) ДНК HBV. Среди 42 пациентов положительных на РНК HCV у 19 (45%) была также обнаружена РНК HGV. Высокая частота коинфекции HGV при вирусных гепатитах В и С свидетельствует о необходимости изучения вклада вируса в развитие. Welcome To Linkbot Welcome to Linkbot 4.1 Some useful Linkbot references: Linkbot tutorial Linkbot product information Linkbot support Feedback Linkbot purchasing information Copyright (c) 1998 Tetranet Software Incorporated. All rights reserved. Что такое ПЦР ЧТО ТАКОЕ ПЦР Раздел ЧТО ТАКОЕ ПЦР содержит информацию о полимеразной цепной реакции - методе молекулярной диагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция, известная более как "ПЦР" не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии.Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. "Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК- репликацию (размножение), делает его копии. Результат? В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах. Это особенно актуально для медицинской диагностики и ПЦР открывает для этого новые перспективы. ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом", проверен временем и тщательно апробирован клинически. Необычайная чувствительность метода позволяет нашим специалистам гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий - воспроизводимое выявление 100 микроорганизмов в исследуемой биологической пробе (1000 МИКРООРГАНИЗМОВ В 1 МЛ) Специфичность ПЦР при использовании технологии АмплиСенс даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. УПРОЩЕН ЗАБОР ОБРАЗЦОВ Требования к забору образцов биологического материала, по сравнению с бактериальными и вирусными методами, значительно упрощены. ПРОСТАЯ ТРАНСПОРТИРОВКА В ЛАБОРАТОРИЮ Простые требования к условиям хранения и транспортировки материала от пациента в лабораторию. Увеличена стабильность при транспортировке до нашей лаборатории, так как нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде, по сравнению с бактериологическими и вирусологическими методами. БЫСТРЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Время получение результатов, для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.